挥发性萜烯是植物花卉和果实中重要的活性芳香剂。烯合酶（TPS）的类型和功能决定了物种中萜烯的多样性。花是重要的芬芳开花植物。烯是其气味的重要成分，但是桂花萜烯合酶的研究并不多。了揭示桂花萜类生物合成的机理，本研究使用生物信息学技术分析了四种TPS蛋白的理化性质，亚细胞定位和结构，并在体外系统中表达了四种TPS蛋白。核表达，并在体外进行了重组可溶性蛋白TPS4的功能分析。果表明：（1）四种TPS蛋白的理化性质差异很小，但只有TPS4蛋白定位于其他靶标，不含信号肽，延伸链比例低，在氨基末端附近的区域不包含延伸链。（2）这四种TPS蛋白可以在原核系统中成功表达，但是只有TPS4获得了可溶性重组蛋白。（3）将纯化的重组蛋白TPS4分别与GPP，NDP和FPP反应，仅检测到一种产物，即反式-β-oc烯，β-el烯和α-法呢烯。为揭示植物萜烯生物合成的分子机理提供了参考，为从蛋白质水平研究桂花花卉基因的功能奠定了基础。烯是植物中重要的挥发物，也是形成花和果香气的重要活性物质，包括单萜烯，倍半萜烯和不规则萜烯（Moses等人，2013； Dudareva等人） 。2013）。同物种的组成和萜烯含量有很大不同：Xiong等。（2012）分析李子蜡油的挥发性成分主要是倍半萜。花ym兰花主要是单萜类化合物（Zhang Ying et al。2013）;李子的挥发性成分中的萜烯含量非常低（Zhao Yinquan等，2010）。一物种内不同物种之间材料的成分和含量存在某些差异。永琴等。（2013）比较了不同品种李子蜡花的香精油成分，发现``老蜡李中的石竹烯含量相对较高，而``扬州黄主要是萜烯。β-荜chengola油。于不同物种之间萜烯的多样性，近年来它已成为科学研究的热点。物萜有两种合成途径：2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径和甲羟戊酸（MVA）途径（Nagegowda，2010）。烯合酶（TPS）是一种反应酶，作用于萜烯物质合成的最后阶段，并使用MEP途径产生的香叶基焦磷酸（GPP）或MVA途径产生的甲硫基焦磷酸（FPP）进一步被各种萜烯催化（Tholl，2006; Degenhardt et al。2009）。些TPS物种可以催化GPP和FPP产生的顺式异构体二磷酸神经磷酸酯（NDP）和Z，Z-FPP。化合物（Bleeker等人，2011）TPS的类型和功能通常决定物种中萜烯种类的多样性，不同物种中萜烯合酶的种类和功能也有很大差异（Tholl等人， 2005; Garms等，2010; Martin等，2010）。前，萜烯合酶的挖掘和功能分析仅在少数物种中才能完成，例如拟南芥，葡萄，猕猴桃和尚未研究的其他物种。
花是一种著名的芳香植物，在香水，香水和高端化妆品行业中，花卉和精油的需求量很大。花的挥发性成分主要是萜烯，芳香族化合物和酯类（曹辉等，2009；杨秀莲等，2015）。烯是主要的重要芳族成分和活性物质。要成分是单萜和不规则萜（Xin等，2013； Cai等，2014）。花的不同品种的组成和萜烯含量差异很大。Cai等人的研究。（2014）揭示，反式-β-烯菊酯在``厚皮瓣英桂中含量最高，β-紫罗兰酮在``甜叶桂桂中含量最高，而芳樟醇是最常出现在``Cadram Orange Dangui中。Zeng等。
（2015）发现TPS是导致不同品种之间萜烯香气成分差异的关键基因。
其中克隆了TPS基因的四个成员，并在烟草中进行了初步功能检查。研究小组先前研究的基础上，本研究分析了这四种TPS蛋白的理化性质，亚细胞定位和结构，分析了生物学信息，构建了可在大肠杆菌中体外表达的原核表达载体。肠埃希氏菌并纯化可溶性重组蛋白以用于体外酶。能验证为揭示桂花萜类化合物生物合成的分子机制提供了参考，这将有助于将来改善和增强其他物种的香气。用的植物材料是健康植物桂花Liuye jingui，它是华中农业大学校园苗圃中的健康植物，光线均匀且没有寄生虫。重后，将采样材料立即在液氮中冷冻，并尽快转移到-80°C的冰箱中进行存储。用研究小组的前克隆获得基因编码区的序列，并将其上传至NCBI基因数据库[GeneBank＃KT591180（TPS1），KT591181（TPS2），KT591182（TPS3）和KT591183（TPS4）]。白质的生物信息学分析生物信息学分析网站（表1）用于预测编码蛋白的理化性质，亚细胞定位，转运肽和二级蛋白结构，为表达载体的构建及体外蛋白功能分析原核表达载体的构建。
据基因的编码序列设计引物。游引物不包含ATG起始密码子和N端信号肽序列。StuI和XbaI用作双重限制位点。物序列在表2中给出。用实验室中存储的TA克隆载体作为模型，将靶片段连接到原核表达载体pET6xHN（Clontech）中，并选择阳性克隆。发送给公司进行排序。全测序的原核表达载体转化了感受态Transetta（DE3）细胞（全金）。大肠杆菌中诱导重组质粒的诱导和SDS-PAGE分析选择Transetta（DE3）的阳性菌株，并将其接种在2 mL LB培养基（100 mg·L-1Amp）中，在37℃200 r·min-1 。搅拌下培养12小时后，将细菌溶液扩展至1:50的比例。37℃200 r·min-1振荡培养直至OD 600 nm为0.6〜0.8后，加入IPTG终浓度为0.2 mmol·L。-1。150μm-1至18μm诱导表达14至16小时后收集细菌液。为阴性对照，将没有目的基因的，用pET6xHN转化的Transetta（DE3）大肠杆菌用作阴性对照。收集的细菌量，将原始细菌溶液的1/10体积加到1×PBS缓冲液中，添加溶菌酶至终浓度0.75 mgmL-1，然后将DNase I添加到1UmL-1，放回悬浮并超声3次，每次10 s，在冰上放置30 s。10，
桂花树价格000×g下于4℃离心4分钟，将上清液放入干净的离心管中，然后将沉淀重悬于1x体积为原始细菌体积的PBS缓冲液中。获得的上清液和沉淀悬浮液中添加等体积的2×SDS上样缓冲液，混合并在95°C加热3至5分钟，以10，000×g离心2分钟，然后将样品上样至SDS- PAGE（5％凝胶浓度，12％分离凝胶），以检测蛋白质表达结果。组蛋白的分离纯化及体外酶活性的分析取剩下的表达稳定，重组蛋白溶解性好的细菌液沉淀，加入Histaron xTractor缓冲液，比例为1 mg细菌沉淀和20微升细菌裂解液，并重悬沉淀。每2 ml HisTALON xTractor缓冲液中加入1μLDNAse（1U·μL-1），轻轻混合，在冰上放置15分钟，间歇混合，并在10，000×g下于4℃离心20分钟，收集小心清洁上清液通过0.45μm过滤器吸滤溶液。考说明书，使用HisTALON TM重力柱（Clontech）纯化重组蛋白。过Bradford方法检测重组蛋白的浓度，并通过SDS-PAGE分析纯化过程中收集的组分。了不受后续研究的影响，通过PD-10（GE）柱过滤除去纯化的蛋白溶液中过量的咪唑，并更换原始洗脱缓冲液反应缓冲液[15mmol·L-1MOPSO，12.5％（v / v）甘油，1mmol·L-1抗坏血酸，1μL·mL-1吐温20、1mmol·L-1氯化物镁，2mmol·L-1DTT，pH 7.0]。
5 ml可密封的反应烧瓶中加入50μg重组蛋白（50μg重组蛋白在100°C加热5分钟作为对照）和终浓度为10μmol·L-1的底物，并添加Le将反应缓冲液减少至2ml，充分混合并密封。其置于28℃，125rpm的速度的振动器上，并反应40分钟。后将固相微萃取萃取头（SPME）插入反应瓶中，静置40分钟。取完成后，进行GC-MS分析。GC-MS分析使用30 m×0.25 mm×0.25μm的HP-5MS毛细管柱（J W Scientific）进行色谱分离。纯氦气（99.999％）被用作载气，流速为1.2 mL·min-1。谱分析条件：柱的初始温度为40℃，并保持3分钟；以3min·min-1的速度升至73℃3分钟。温至220℃至5℃·min-1 2min。
合四极质谱HP5975B（安捷伦科技公司）进行质谱分析，质谱条件如下：传输线温度为250℃；离子源温度为220℃。EI电离模式；电子的能量为70 eV；扫描的质谱范围是45-450 amu。相同条件下，对标准C8-C40正构石蜡（每种化合物浓度为0.005μLmL-1）（Sigma-Aldrich）进行GC-MS分析，计算保留度（RI）目标物质。接到ProtParam以分析四种TPS蛋白的理化特性。果列于表3。PS1蛋白由581个氨基酸组成，相对分子量为67.27，理论等电点为5.49，带负电荷的残基Asp Glu 82，带正电荷的残基Arg Lys 69，半衰期为30小时，不稳定系数为55.60（稳定时，不稳定系数<40），属于不稳定蛋白质，脂肪系数为92， 19，平均疏水性是-0.274，它是一种亲水性蛋白质。TPS2蛋白由555个氨基酸组成，相对分子量为63.68，理论等电点为6.08，带负电荷的残基Asp Glu 74，带正电荷的残基Arg Lys 65，半衰期30小时后，不稳定性系数为35.03，这是一种稳定的蛋白质，其脂肪系数为87.35，平均疏水性为-0.350，它是一种亲水性蛋白质。TPS3蛋白由591个氨基酸组成，相对分子量为68.27，理论等电点为6.07，带负电的残基Asp Glu 74，带正电的残基Arg Lys 67，半衰期30小时，不稳定系数48.01，这是不稳定的。蛋白质的脂肪系数为88.97，平均疏水性为-0.299，是一种亲水性蛋白质。TPS4蛋白由548个氨基酸组成，相对分子量为63.53，理论等电点为5.23，带负电荷的残基Asp Glu 75，带正电荷的残基Arg Lys 54，半衰期30小时，不稳定系数52.04，这是不稳定的。蛋白质的脂肪系数为97.12，平均疏水性为-0.247，是一种亲水性蛋白质。用的在线工具TargetP 1.1 Server用于预测TPS蛋白的亚细胞定位。果显示在表4中。PS1在叶绿体中的定位概率为0.831，线粒体的定位概率为0.131，分泌蛋白质的概率为0.028，其他可能性为0.067，因此叶绿体中定位的可靠性最高。叶绿体中发现TPS2的概率为0.226，线粒体的概率为0.530，分泌蛋白质的概率为0.028，另一种可能性为0.196，因此可以定位线粒体。TPS3在叶绿体中定位的概率为0.409，线粒体为0.222，分泌蛋白质的概率为0.071，另一可能性为0.245，因此它可以定位在叶绿体中。叶绿体中发现TPS4的机率是0.145，线粒体的机率是0.147，分泌蛋白质的机率是0.100，另一种机率是0.804。4种TPS蛋白的SignalP 4.1服务器的分析未显示任何明显的信号肽和信号肽切割位点，并且未列出结果。ChloroP 1.1 Server分析认为，TPS1和TPS3的转运肽长度分别为47和38个氨基酸。用SPOMA预测TPS的二级结构，结果显示在表5和图1中。PS1蛋白中的391个氨基酸形成一个α螺旋，占最大比例，为67.30％。32个氨基酸形成延长链，占5.51％； β塔中有21个氨基酸，占3.61％； 137个规则循环，占整个链的23.58％。TPS2蛋白中的369个氨基酸形成一个α螺旋，占最大比例，为66.49％； 23个氨基酸形成延长链，占4.14％； 21个氨基酸形成一个β塔，占3.78％； 142个常规循环形式，占整个链的25.59％。TPS3蛋白具有399个氨基酸，形成一个α螺旋，占67.51％； 25个氨基酸形成延长链，占4.23％；组成β塔的17个氨基酸，占2.88％；其中150个规则循环，占整个链的25.38％。TPS4蛋白中的379个氨基酸形成一个α螺旋，占最大比例，占69.16％； 20个氨基酸形成延长链，占3.65％； β塔中有19个氨基酸，占3.47％； 130和130构成规则循环，占整个链的23.72％。图1可以看出，蛋白质TPS1，TPS2和TPS3均在N端具有延伸链，TPS1的延伸链密度最大，其次是TPS3和TPS2。TPS4的N端没有延伸链。TPS1的N端延伸区覆盖59个氨基酸，TPS2包含42个氨基酸，TPS3包含46个氨基酸。构建原核表达载体时，TPS1和TPS3分别从47和38个氨基酸中去除了转运肽，并且这四个蛋白的N末端添加了24个氨基酸的组蛋白标签。ProtParam预测的重组蛋白的分子量为65、66、67、66 kDa。建正确的原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌Transetta DE3中。导后，四种重组蛋白可以在大肠杆菌中成功表达，表达的分子量在50至70 kDa之间，表明预期的蛋白大小。致（图2：A）。析了表达的重组蛋白的溶解度。果，仅TPS4蛋白在上清液中表达，而其他三种重组蛋白在上清液中几乎无法检测到（图2：B）。TPS4蛋白被进一步分离和纯化。白质分离和纯化的整个过程如图2所示：C.最后，可以获得具有更好完整性和更高纯度的重组蛋白质TPS4，可将其用于更深入的蛋白质分析。白质功能。化的重组蛋白TPS4分别与GPP，FPP和NDP底物在反应缓冲液中反应，并通过SPME-GC-MS方法检测反应产物（图3）。图3所示，与高温灭活后的重组蛋白TPS（CK）相比，未加热的蛋白与GPP反应，并且在保留时间（RT）16.95min处出现独特的特征峰。谱分析和保留后，该指数（RI = 1047）被确定为反式-β-烯菊酯；与FPP反应后，在33.30分钟的保留时间（RT = 1505）处出现一个特征峰，该峰被鉴定为α-法呢烯。NDP反应后，在保留时间（RT = 1021）16.90 min处出现一个较弱的特征峰，该峰被鉴定为β-水芹烯。白质与三种类型的底物分别反应，所有底物均产生单个化合物。肠杆菌的原核表达系统。肠埃希氏菌具有清晰的遗传背景，简单的文化和广泛的应用特点。可用于蛋白质的功能验证，酶活性分析，抗体制备等领域（Cabrita Bottomley，2004； Terpe，2006）。得高产量和以可溶性形式表达的外源重组蛋白是实际应用的关键。而，蛋白质的溶解度与其氨基酸组成，蛋白质的亲水性，等电点等有一定的关系，在原核系统中表达的真核蛋白质通常以不溶的包涵体形式存在。有生物学活性（Wilkinson Harrison，1991； Shimada等，2005）。这项研究中，来自桂花的四种TPS蛋白在大肠杆菌的原核系统中表达。肠杆菌，但只有TPS4获得可溶性蛋白，而其他三个重组蛋白则作为包涵体存在。过比较它们的物理和化学性质，发现这四种TPS蛋白都是亲水蛋白；它们是亲水蛋白。TPS4蛋白的物理和化学性质与其他三种蛋白没有太大区别。TPS4的等电点和带正电荷的残基略低，而脂肪系数则略高。细胞定位和信号肽的预测表明，TPS1和TPS3位于塑料中，分别在该蛋白的氨基末端具有47和38个氨基酸转运肽。去预期的转运肽后，TPS1蛋白的等电点为5.22，脂肪系数为95.19，带正电荷的残基为63，与TPS1蛋白的TPS4蛋白（结果未列出）。
以看出，蛋白质的理化特性不是其他三种TPS形成包涵体的主要原因。究表明，信号肽可导致原核表达系统中包涵体的形成（Bohlmann等，1998； Crowell等，2002）。这项研究中，只有TPS1和TPS3预测了重要的转运肽。过比较这四个TPS蛋白的二级结构，发现TPS4中的α螺旋比率高于其他三个，而延伸链比率则低于其他三个蛋白质。TPS1，TPS2和TPS3的氨基末端附近存在延伸链，但在TPS4的氨基末端没有延伸链。TPS1，TPS2和TPS3氨基酸的延伸范围超过了转运肽预期长度的区域，表明它们实际上是该肽的长度。号肽的长度可能大于预测值。表明二级结构的延伸链与蛋白质存在区域的比例可能影响蛋白质在原核系统中的溶解度。烯合酶是中等大小的蛋白质家族。多数萜烯合酶具有催化GPP和FPP的双重功能，产生不同类型的萜烯（Tholl，2006； Chen等，2011）。们之前注意到，在烟草中表达的四个TPS基因只能检测到一种产物，而TPS4基因产物是倍半萜烯α-法呢烯物质（Zeng等人，2015）。这项研究中，可溶性TPS4蛋白分别与GPP，FPP和NDP反应，并检测了底物。
同一系统中，TPS4蛋白与GPP反应生成反式-β-oc烯，TPS4蛋白与FPP反应生成大量的α-法呢烯，而只有少量的β-ph烯在与NDP的反应中检测到FPS底物，表明FPS底物具有最高的活性。管它可以催化GPP的顺式NDP异构体，但其有效性不高。们还早些时候发现，烟草中TPS3基因的表达也产生了反式β-ocimene，并且TPS3和TPS4在TPS-b亚家族中均聚（Zeng等人，2015）。表明桂花中的TPS4具有催化GPP和FPP的双重功能。不仅相对靠近TPS3，而且可以催化相同的反应，应该是同工酶。管烟草基因的表达和体外酶活性的分析表明，从花瓣中获得的TPS4可以产生α-法呢烯倍半萜（Zeng等，2015）。而，研究表明，桂花花瓣中的挥发物很少含有倍半萜烯，尚未检测到α-法尼烯的存在（Cao Hui等，2009; Xin等，2009）。2013;杨秀莲等，2015）。可能是由于两个原因：一是桂花花瓣中TPS4的基因表达量过低。一个是桂花花瓣中缺乏FPP底物。究结果为揭示桂花萜烯生物合成机理提供了参考，为从蛋白质水平研究桂花花香的形成奠定了基础。
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