国产桂花BtCry1Ab和BtCry1AbVip3Aa对草地贪夜蛾的抗性

　　斜纹夜蛾（Spodoptera frugiperda）（J。. Smith）是全世界主要的农业害虫。植转基因Bt作物是控制的主要方法之一。们使用1到4个阶段的食鳞夜蛾方法评估了Bt-Cry1Ab桂花（转化体C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花（转化体DBN3601和DBN3608）对1到4个阶段的食虫夜蛾的毒力。内生物测定。果表明，经测试的六个桂花转基因品种均能有效表达目标杀虫蛋白，并对节叶夜蛾有很强的毒性作用，其第一龄幼虫的致死率达到59％至100％，活了下来。

　　虫的生长和发育也被显着抑制。果表明，Bt-Cry1Ab桂花和Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花对斜纹夜蛾有良好的防治效果，其中Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花比Bt-Cb好得多。基因桂花具有商业应用的良好前景。Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）是一种杂食性害虫，最初分布于美洲大陆的热带和亚热带地区[1]，其寄主植物有多达76个科和353种[2]。其他主要的迁徙性农业害虫一样，它具有“国际性，迁徙性，爆炸性和破坏性”特征[3]，现已成为严重威胁世界粮食安全的重大生物灾害。桂花为食的幼虫和桂花叶上的幼虫可引起“窗洞”症状。叶片上的孔洞外，幼虫还会损害叶片，叶鞘，橡子和耳朵[4]，严重影响桂花的性能。

　　报道，在1960年代阿根廷东北部，斜纹夜蛾造成的桂花产量损失高达70％。2000年，在阿根廷西北部，受到草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）影响的桂花植物比例达到71％[5]。巴西，斜纹夜蛾可使桂花的产量降低34％，每年造成近4亿美元的经济损失[6]。2018年的西非加纳，斜纹夜蛾造成的桂花产量平均损失26.6％（最高40％），经济损失为1.77亿美元。南部地区，造成桂花平均损失35％（最多50％）。），经济损失为1.59亿美元[78]。

　　学防治是控制节食夜蛾危害的主要方法[9]，但是由于节食夜蛾幼虫经常在桂花叶的背面和心脏的叶子中进食，因此较大的幼虫甚至可能刺穿植物，使农药不足。
　　暴露于昆虫时，它们通常无法达到良好的防治效果[10]。时，随着化学农药的不断使用，欧洲斜纹夜蛾种群逐渐产生了抗药性。报道说，在美洲部分地区，草地贪夜蛾已暴露于氨基甲酸酯，有机磷酸盐和除虫菊。类农药已经产生了抗药性[8]，这导致化学防治的有效性不断下降。
　　着科学技术的发展，对转基因昆虫具有抗性的桂花的研究开发和商业化栽培为防治斜纹夜蛾（Spodoptera frugiperda）开辟了新途径，并已成为控制和防治杂藻的最广泛技术手段。制美洲大陆热带和亚热带地区的斜纹夜蛾。今为止，表达Cry1F，Cry1Ab或Cry1A.105 Cry2Ab2蛋白的Bt桂花已经在美国，加拿大和部分南美地区进行了商业种植。中，Cry1F桂花TC1507是栽培最广的[11]。南非，2018年11月，草地贪夜蛾被列为表达蛋白质Cry1A.105 Cry2Ab2的MON89034桂花（Bt2）的靶害虫[12]。前已批准在美洲或非洲种植的抗昆虫转基因桂花包括MON810，Bt11，MON89034，MON89034×TC1507，MIR162，桂花树价格Bt11×MIR162和MON810 ×TC1507×MIR162等，表达的蛋白类型为Cry1Ab，Cry1F，Cry2Ab2，Cry1A.105和Vip3Aa20 [10]。
　　食斜纹夜蛾于2019年1月入侵中国云南省[13]，5月10日在云南，广西，广东，贵州，湖南，海南，福建的13个省（区）被发现，浙江，湖北，四川和江西。261个县（市，区）遭受了破坏，总面积超过67，000 hm2，这对中国的桂花生产构成了重大威胁。据饲喂寄主植物的喜好，将斜纹夜蛾分为喜欢吃桂花的“桂花型”和喜欢米饭的“大米型” [1415]。侵种群的分子鉴定结果表明，中国所有地区的斜纹夜蛾蝗虫均为桂花型[16]。了开发一种新的技术来控制节食斜纹夜蛾，我们使用人工接种的方法测量了该国生产的桂花Bt-Cry1Ab（转化体C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）（转化体DBN3601和DBN3608）。花。）对节食夜蛾幼虫第1-4幼虫期的抗性。Bt桂花是由北京大贝农生物技术有限公司提供的，其中“ C0030.3.5-Zhengdan958”和“ C0030.3.5-Nonghua106”是对单基因昆虫桂花具有抗性的Bt-Cry1Ab，“ DBN3601-Zhengdan958” ”。“ DBN3608-Zhengdan958”，“ DBN3601-Nonghua106”和“ DBN3608-Nonghua106”是Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）双基因抗虫桂花，“ Zhengdan958”和“ Nonghua106”，与桂花比较。花的所有品种均在（26±1）°C的培养箱中生长.2019年1月19日，在德宏州的新鲜食品桂花田中采集了Spodoptera frugiperda的种群。南省。共收集了超过100个2至5个阶段的幼虫，并在室内用桂花叶饲养，直到the长出。10％的糖水喂养以补充营养和水分。虫下蛋后收集卵，并用大豆粉和桂花制成的人工饲料饲养孵化的幼虫，并使用不同年龄的幼虫进行实验。有的幼虫和成虫均在温度为（26±1）℃，湿度为60％±10％且光周期为L∥D= 16h∥8h的培养箱中培养。ELISA法检测了桂花叶片中杀虫蛋白的含量。叶期V2-2处的桂花植物的顶部的第二片叶被取出。个叶片类型使用5片叶片作为生物复制品。共配置了3个生物学重复，每个生物学重复都配置了3个技术重复。新鲜的桂花叶用液氮在研钵中迅速研磨成粉末，然后加入PBST提取液（pH 7.4、0.01 mol / L PBS 0.55％Tween 20）加入并在4°C的振荡器上放置过夜; 12000 r离心机15分钟/分钟，取上清液，并用适量提取物稀释；通过梯度稀释标准Cry1Ab和Vip3Aa，向96孔微量滴定板的每个孔中添加50μL酶结合物Cry1Ab或Vip3Aa，然后添加50μL样品，阴性对照和标准对照，并用封口膜，轻轻混合20至30 s，置于搅拌器（200 rpm）上1至2 h；弃去液体，向每个孔中加入200μl每种洗涤液，洗涤3次并用吸水纸洗涤；向每个孔中添加100μL生色底物，用石蜡膜密封微量滴定板，盖上铝箔以避光，并轻轻摇动混合20〜30 s。室温下放置15至30分钟；向每个孔中加入100μL终止溶液以终止反应，并使用酶标仪测量450 nm处的OD值。花播种后约10天进行了抗虫性测试，并且长时间未与其他杀虫物质接触。桂花的新鲜植物插入玻璃指管（高12厘米，直径3.3厘米）中，其中约2厘米高，琼脂含量为2％，并有不同年龄的幼虫被连接到桂花的叶子上，每株植物收到了5个第一龄幼虫。了避免同类相食对第二，第三和第四阶段的幼虫的影响，每株植物分别接受一个，每个年龄的50个幼虫并建立了三个重复，共150次幼虫。指的吹口用棉塞闭合，以防止幼虫刺穿。后置于温度为（26±1）℃，湿度为60％±10％且光周期为L∥D= 16h∥8h的培养箱中。5天后，检查幼虫死亡率，用刷子触摸蠕虫的身体，那些不能正常爬行的人被认为已经死亡，并称量在不同桂花植物上存活的幼虫的比率，以计算出其发生率。制体重。据实验数据，参考公式（1）和（2）计算每个处理幼虫的校正死亡率，并参考公式（3）计算体重抑制率。用SAS 9.2统计分析软件通过方差分析对所有数据进行分析，并使用邓肯的新复数范围方法进行多重比较分析。种类型的Bt-Cry1Ab桂花，四种类型的Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花和两种控制常规桂花的叶子中Cry1Ab，Vip3Aa的含量和总蛋白的含量见表1。联免疫吸附试验结果表明，两种经典对照桂花的Cry1Ab含量　　53.02％±6.71％，后者与Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）的校正死亡率分别为68.68％±2.24％和68.18％±6.01％并无显着差异。）桂花2和Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花3（图2）。治疗前和治疗后5天使用电子秤称量每个幼虫阶段的幼虫，因为第一阶段的幼虫太小而无法在治疗前和进食Bt桂花后食用，因此本节仅分析2，3还有四龄幼虫。果表明，转基因桂花果蝇显着抑制了幼虫的体重增加，并且转基因桂花果树的各个年龄段的摄食幼虫的重量均显着低于对照桂花果树。
　　Bt-Cry1Ab桂花1和Bt-Cry1Ab桂花2对第二和第三阶段幼虫的体重抑制率可达到92.62％〜107.97％，而对Bt-Cry1Ab桂花的抑制率可达到92.62％〜107.97％。四龄幼虫为59.50％〜72.49％（表2）。4种类型的Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花上，五天后第二阶段幼虫的死亡率为100％，因此无法称重治疗后的体重。种类型的Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花对第三阶段幼虫的体重抑制率为109.12％〜122.22％，第四阶段对桂苗的体重抑制率阶段为76.12％〜92.43％。国平的研究表明，蛋白质Cry1Ab，Cry1F，Vip3A和Cry2Ab对节节夜蛾入侵大草原具有很强的致死作用，而Cry1Ac的作用较差。

　　此，Cry1Ab，Cry1F或Cry1Ab（或Cry1F） VipAb Cry1F） Cry2Ab桂花可以控制节叶夜蛾的发病和危害[17]。
　　究结果表明，以Bt-Cry1Ab桂花为食，纠正后的节食夜蛾幼虫的死亡率在13.33％至65.41％之间，体重抑制率为59.50％至107.97％。桂花Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）为例，校正后的死亡率为53.02％至100％，体重抑制率为76.12％至122.22％ 。Bt-Cry1Ab桂花和Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花已显示出对节食斜纹夜蛾幼虫的1至4个幼虫阶段具有良好的控制效果，其中Bt-（Cry1Ab Vip3Aa is Osmanthus） Bt-Cry1Ab桂花和Bt桂花对幼龄和老龄幼虫的控制效果显着优于三，四龄幼虫。于斜纹夜蛾的寄主作物比较大，必须配合使用Bt桂花和化学农药的生产，以达到区域控制的目的。胜元等人的研究表明，20％的氰戊菊酯乳油，15％的氟苯二酰胺SC和25 g / L的溴氰菊酯乳油对节食夜蛾卵，1％甲基氨基苯甲酸盐具有较高的毒性。维菌素乳油，5％甲基氨基苯甲酸酯阿维菌素ME和75％乙酰乙酸甲硫氨酸SP对节叶夜蛾的幼虫有很强的毒性作用[9]。此，在实际生产过程中，根据作物种植结构和不同部位斜纹夜蛾的发生规律，这些高效化学农药和Bt桂花协同控制技术体系可能更多。成。管转基因抗虫性桂花可以有效地控制食蚜蝇的危害，例如化学农药，但是如果长期大量种植Bt桂花，则整个过程中仍会被Bt杀死害虫生长季节。蠕虫蛋白质选择的高压下，对Bt的抗性种群将逐渐进化。多黎各于2003年开始对表达Cry1F的桂花进行商业化种植，但在2006年底发现，草地贪夜蛾的种群已对Cry1F桂花产生了抗药性[18]。2008年，巴西首次引入了Cry1Ab桂花（转化MON810）。年后，发现草地贪夜蛾在该处产生了抗药性。2009年，引入了Cry1F桂花，并在三年内发展了抗药性。2010年推出了Cry1A.105 。2013年，Cry2Ab2桂花在地面上形成了抗药性种群[19]。Huang等报道，美国东南部的草地贪夜蛾种群已经对Cry1F蛋白和Cry1A.105蛋白产生了抗药性[2021]。2017年，Chandrasena等人发现阿根廷的草地贪夜蛾种群对Cry1F有抗性[11]。管国际上已经提出了多种耐药性管理策略，但是高剂量庇护所和多基因策略被最广泛地使用。中国，使用“自然庇护所策略”有效地延缓了棉虫对Bt棉的抗性发展，而使用“人工庇护所策略”有效地延缓了棉铃虫对Bt棉的抗性。虫对Bt棉的抗性达到Bt-Cry1A。花的可持续栽培[22]为Bt桂花的栽培提供了成功的实验。的杀虫蛋白的开发还提供了更多的抗Bt抗性的策略，例如苏云金芽孢杆菌在对数生长期产生的植物杀虫蛋白Bt（Vips），以及哀悼的晶体蛋白。胚泡形成过程中产生的产物不是交叉抗性的。达Vip3Aa20蛋白的转基因桂花已经在美国，阿根廷和巴西进行了商业种植。花可用于控制对Cry杀虫蛋白具有抗性的Spodoptera frugiperda种群。目前为止，在美洲许多商业化种植的桂花中，草地夜蛾对Vip3Aa20桂花仍然很敏感，在田间未发现控制草地夜蛾的失败[19]。国许多公司已经成功开发了抗昆虫的Bm桂花，我们已经开发了Bt-Cry1Ab（转化C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab Vip3Aa）桂花（转化DBN3601和对昆虫的抗性测定DBN3608）。明中国具有开发和销售抗虫转基因桂花的能力。虑到害虫（如斜纹夜蛾和其他鳞翅目）的严重性，应尽快促进转基因抗虫性桂花的销售过程，并应采用先进的技术手段提供服务和支持发展中国优质植物的生产。
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