转基因桂花MON89034MON810MIR162双数字PCR定量方法的实

　　针对涉及更多转基因的桂花MON89034，MON810和MIR162的进出口贸易，研究了一套使用数字双重PCR（dPCR）的定量检测方法，包括引物探针的序列和浓度，DNA模型的浓度和PCR反应过程的时间。温度等该方法的定量限为0.1％，转基因的定量检测范围为0.1％至100％，线性系数为0.999，准确度优于10％。这种检测方法中，每个微反应系统都包含两组引物探针，分别通过FAM和VIC荧光通道进行检测，可以同时检测内源和外源基因，避免了定量差异由相同样本的采样不一致引起的。
　　方法可同时应用于dPCR液滴平台和市场上最常用的3D芯片dPCR平台，两种方法的定量结果是一致的。者简介：梁雯（1986-），女，来自四川德阳，工程师，硕士，主要从事转基因检测方法和定量核酸方法的研究。讯作者：刘刚（1982-），男，山东青岛人，工程学博士，主要从事核酸检测方法的研究。着生物技术产业的飞速发展，全球转基因作物的研究开发速度和面积不断增加，转基因食品的安全性问题也成为世界上的热点。界[1]。制转基因生物的含量和实施转基因食品标签制度是各国加强转基因管理的重要措施。

　　
　　基因检测方法分为核酸检测和蛋白质检测。酸含量在生物细胞中相对稳定，在产品加工过程中破坏它相对困难。外，核酸检测方法灵敏度高，使用简便，因此成为转基因检测的主要方法[2]。用的核酸检测方法包括等温扩增，普通PCR，多重PCR，实时定量荧光（qPCR），数字PCR（dPCR）等方法[3]。前，常用的qPCR方法可以筛选特定的转基因DNA片段，但大多数qPCR在检测转基因方法中的应用仍处于定性阶段[4]。dPCR作为一种新的PCR技术，已在各个检测领域迅速发展，并具有独特的优势，特别是在转基因的定量检测中。dPCR的技术特征是它不需要建立工作曲线，并且避免了由标准液的制备过程引起的偏差以及标准液和待测样品之间的自然差异[5]。]。DPCR使用终点荧光检测，在从转基因样品中提取DNA的过程中，微小反应单元的独立扩增不容易受到抑制剂的影响[6]。DPCR对转基因DNA样品的检测具有很高的定量精度和良好的重复性[7]。dPCR检测系统中，设计了双重荧光检测分别标记外源基因和内源基因，可以实现内源基因和外源基因的双重检测，进一步避免了加载错误，减少了检测成本，提高检测效率。本文中，内源基因和外源基因的同时检测是在桂花MON89034，MON810和MIR162转基因菌株的定量检测系统中进行的。源基因和内源基因的拷贝数是通过反应直接获得的，外源基因与源基因的拷贝数浓度之比，即转基因的含量[8] 。前，市场上的dPCR分为两类：液滴PCR和芯片PCR。者在形成独立的PCR反应微单元和加热介质方面有所不同。文首先在芯片dPCR平台上建立了一种实验方法，以研究其特异性，定量极限，线性范围和精度。后，将该方法应用于dPCR液滴，并研究了两个平台之间结果的一致性。物基因组DNA提取试剂盒（北京天根DP305）；引物和探针（上海布里格利）； 3D数字PCR系统（QuantStudioTM3D，ABI）;数字液滴PCR（QX200，Bole）;核酸定量仪（Nanodrop2000，热）。基因参考材料：GM桂花MON810种子粉（ERM-BF413gk），GM桂花MON89034种子粉（AOCS 0906-E），GM桂花MIR162种子粉（AOCS1208-A），所有种子粉是F1杂合子。用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒进行了桂花基因组DNA提取。提取过程中，必须使用苯酚氯仿才能有效地从桂花原料中去除多糖和多酚。取后，用核酸定量仪对DNA浓度进行定量，其A260 / A280应在1.8至2.0之间。dPCR方法中模板DNA的浓度受到泊松分布原理的限制，也就是说，在大量微反应单元（超过10，000个）中， DNA基质必须是随机的。于目前市场上用于dPCR的微反应单元的数量至少为10000，因此，如果定量结果的可重复性优于25％（相对于0.1％的定量限） ，必须确保上样系统中模型DNA的浓度。DNA模型的总数（内源基因的拷贝数）在4，700到73，551拷贝之间[9]。了避免在低GMO含量的样品中漏掉GMO片段的采样，并避免DNA的拷贝数过高而降低数据准确性的情况由于正过载。有桂花品系的内源基因均以Adh-1基因为靶标检测基因，外源基因选择每株桂花品系的特异性序列[10-11]。物探针的序列列于表1。转基因实例MON89034为例，通过荧光PCR反应实时验证了设计引物探针的特异性。含有外源转基因MON89034的引物探针或内源基因的Adh-1的引物的PCR反应系统中，转基因菌株桂花MIR162，菌株MON810，桂花GA21，菌株桂花TC1507，菌株分别测定了桂花T25和桂花菌株NK603菌株，桂花树价格转基因桂花MON89034和非转基因桂花菌株的基因组DNA，以验证引物探针系统仅针对MON89034基因组具有菌株特异的外源基因扩增曲线，而其他样品仅具有内源基因扩增。每个桂花转基因菌株的dPCR芯片的反应系统中（总体积为20μL），内源和外源基因的前后引物浓度为500 nmol / L，最终浓度为探针的浓度为100 nmol /L。3D芯片的dPCR反应条件为酶促活化和预变性步骤：96℃，10min；扩增阶段的循环：60℃/ 2min，98℃/ 30s，共40个循环。热速度为0.8℃/ s，冷却速度为1.2℃/ s。转基因产品中定量PCR的定量检测具有很高的灵敏度和良好的特异性，可用于定量检测更多不同的转基因植物品系。本文中，针对涉及进出口贸易的三种桂花桂花MON89034，MON810和MIR162设计了引物探针，以定量检测dPCR。用qPCR对不同的桂花菌株进行鉴定，验证了用于检测3株桂花菌株的引物和探针的特异性。qPCR实验中，具有特定内源和外源基因的引物探针类型很多，但它们可以应用于同一dPCR反应微孔板，而内源和外源基因扩增系统没有互相干扰并不容易，但这并不容易。

　　
　　象是内源或外源基因的扩增受到抑制，从而不能区分来自阴性反应孔和阳性反应孔的荧光信号，从而不能定量qPCR中的反应条件。能直接应用于dPCR。本文中，由于结合了多种引物探针，并筛选了最佳的引物探针浓度，退火温度，PCR反应过程的时间和温度等，建立了完整的桂花转基因dPCR定量检测方法。这种检测方法中，每个微反应系统都包含两组引物探针，分别通过FAM和VIC荧光通道进行检测，这使得可以同时检测内源和外源基因并避免由相同样品的采样不一致引起的定量差异。低测试成本。方法可同时应用于dPCR液滴平台和市场上使用最广泛的3D芯片dPCR平台。两个平台的加热支架非常不同：dPCR芯片是一个金属腔，其微小反应单元的体积变化较小，但热导率稍慢，因此退火延伸需要更多qPCR的时间和经验有很大的区别。dPCR液滴是油中的一滴水，反应过程与qPCR实验基本相同，这也有利于利用qPCR实验来优化PCR反应。是，在优化实验条件后，两个平台的结果非常吻合。T检验中，3种桂花的转基因菌株的平均转基因含量和重复RSD均无显着性差异，该方法的定量限为0.1％，定量检测的范围。基因的范围从0.1％到100％，线性系数为0.999，准确性优于10％。方法快速高效，测试结果的准确性和稳定性优于传统的qPCRa。实验操作中，与qPCR相比，不应建立标准曲线，从而避免购买昂贵的标准材料，并且避免使用标准材料和测试样品。CR扩增效率差异的影响关于实验结果。方法可用于转基因桂花的定量检测，为规范我国转基因监测提供技术支持。

　　
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