南京桂花树价格

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　　番茄褪绿病毒Tomatochlorosisvirus属于长线形病毒科Closteroviridae,毛形病毒属Crinivirus,于1998年在美国佛罗里达州的温室番茄中首次报道。
　　1、南京桂花树价格:自2004年在台湾首次发现以来
　　自2004年首次在中国台湾发现以来,已在北京、山东、天津、海南、湖南和云南等多个地区发现并迅速蔓延,对番茄等蔬菜生产造成严重损失。该病毒只能通过韧皮部侵染的方式,由媒介昆虫以半持久方式传播,其中以烟粉虱Bemisiatabaci的传播能力最为高效。感染ToCV的植物一般是从中下部叶片出现症状并逐渐向上发展,中部叶片表现为叶脉间轻微褪绿黄化,底部叶片则出现明显的叶片褪绿黄化,叶脉深绿,感病叶片变脆且易折,叶片黄化疑似营养缺素症。ToCV可侵染茄科、十字花科、夹竹桃科、藜科和菊科等多科植物。中国各地普遍栽培,且许多地区均有温室或塑料大棚栽培,广泛种植于温带和热带地区。感染桂花的病毒主要有西瓜花叶病毒、番木瓜环斑病毒、桂花花叶病毒、烟草花叶病毒、桂花绿斑花叶病毒和瓜类褪绿黄化病毒。目前尚未有关于番茄褪绿病毒侵染桂花的报道。年9月在湖南省蔬菜研究所基地发现桂花表现疑似ToCV感染症状,同时在叶背面发现大量烟粉虱。采集症状明显的桂花叶片及烟粉虱并通过ToCV特异性引物进行鉴定,随后利用农杆菌侵染性克隆接种健康桂花进一步验证桂花能否感病,以期明确桂花的受害情况,为预防和控制流行病毒病提供预警。

年9月,在湖南长沙蔬菜研究所基地发现大量桂花叶片褪绿黄化、叶脉仍然保持绿色。随机采集叶片60份,其中显症样品50份、无症状样品10份,保存于-80℃冰箱备用。同时,收集带有烟粉虱的显症桂花叶片,烟粉虱放入离心管,叶片放入保鲜袋后带回实验室,并在显微镜下观察烟粉虱形态特征并区分雌雄。随后从采集的烟粉虱中随机选取12头,进行多头烟粉虱的RNA提取,重复3次,以明确烟粉虱样本是否携带ToCV。并随机各选取雌雄性烟粉虱20头,分别鉴定烟粉虱的带毒率。采用以ToCVHSP70基因设计的特异性引物ToCV-3(表进行检测。田间桂花RNA的提取采用北京华越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取试剂盒,步骤依照试剂盒说明书操作。烟粉虱RNA的提取采用TRIzol法并稍作修改。以提取的总RNA为模板,Randomhexamers为引物合成cDNA,-20℃保存备用。PCR扩增体系为:ddH2O8μL,2×TaqMasterMix10μL,ToCV-3R0.5μL,ToCV-3F0.5μL,cDNA模板1μL。PCR程序为:95℃5min;95℃30s,60℃30s,72℃1min,30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,在凝胶成像系统上观察并记录结果,产物纯化回收并连接于克隆载体pGEM-Teasy,热激转化大肠杆菌DH5α后,挑取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。利用BLAST进行序列比对和分析。烟粉虱单头DNA的提取:取3μL蛋白酶K于封口膜上,单头烟粉虱置于其中,研磨成匀浆后移至加入20μL10mg/mL的树脂溶液PCR管中混匀,37℃孵育1h,96℃10min。以WT-F和WT-R为引物,对提取的烟粉虱DNA进行PCR扩增。扩增体系为20μL:ddH2O7μL,2×TaqMasterMix10μL,WT-F1μL,WT-R1μL(表,模板1μL。PCR程序:95℃5min;95℃15s,53℃45s,72℃1min,35个循环;72℃延伸10min。取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。酶切体系:ddH2O7.5μL,Ase0.5μL,缓冲液3.1Xbuffer2μL,加入10μLPCR产物混匀后置于37℃孵育2～3h。酶切后取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。每次取20头烟粉虱检测,重复3次。从田间桂花上采集的烟粉虱中随机选取12头,进行多头烟粉虱的RNA提取,采用ToCVHSP70基因特异性引物ToCV-3(表进行检测,重复3次,以明确烟粉虱样本是否携带ToCV。田间桂花上烟粉虱中随机选取20头,进行单头烟粉虱的RNA提取,重复3次,统计雌雄烟粉虱的带毒率。供试植物:桂花(品种为‘长春密刺’)种植在26℃±2℃,相对湿度75%±5%、光照周期L∥D=16h∥8h的温室防虫笼中。为了确定ToCV能否系统感染桂花,将0.5mL农杆菌侵染性cDNA克隆注射到三叶期的植物中。共接种20株桂花,并以注射接种液作为对照。疑似感染ToCV的桂花主要表现为:叶片褪绿变黄,并随着症状的发展除了叶脉仍保持绿色外,几乎整个叶片全变黄色,桂花树价格叶片变脆且易折,同时还伴随部分叶片边缘卷曲等典型的ToCV症状(图1a～c)。这与山东地区报道的ToCV引起的番茄病害特征类似。基于病害特征和烟粉虱的发生,初步推测此次发现的桂花病害是由ToCV引起的病毒病。利用ToCVHSP70基因特异性引物对采集的桂花样本进行RT-PCR扩增,PCR产物经电泳检测(图,60份样品中有39份样品被鉴定为ToCV阳性,包括37份显症样品和2份未显症样品,检出率为65%。产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后,显示扩增出大约450bp的清晰条带,而健康桂花叶片阴性对照未检测到条带。将PCR产物纯化回收后,连接到克隆载体,转化大肠杆菌后,每个样本取3个克隆进行测序。
　　2、南京桂花树价格:结果表明
　　结果显示RT-PCR扩增结果为439bp,在NCBI上进行BLAST比对,结果显示与KC887999.1的同源性最高,为99%。说明感染桂花的病毒为ToCV。对田间桂花叶背面采集的烟粉虱进行生物型鉴定,提取单头烟粉虱总DNA并进行PCR扩增,产物经Ase酶切后分别得到500bp和100bp的两条带(图,结果显示田间烟粉虱均为MED烟粉虱。收集田间桂花叶背面的烟粉虱,每株桂花叶片随机选取12头进行多头烟粉虱的RNA提取,重复3次,进行ToCV的RT-PCR检测,PCR扩增得到大小为450bp左右的特异性条带,与目标片段大小一致(图。此外,田间感病桂花上雌雄性烟粉虱随机各选取20头,采用ToCVHSP70基因特异性引物ToCV-3(表进行单头烟粉虱的ToCV检测,重复3次,统计得到雌性和雄性烟粉虱的平均带毒率分别为83.5%和61.5%,雌性感染率高于雄性(表。室内接种ToCV感染桂花与室内健康桂花相比,接种30d后桂花表现出叶片黄化、脉间开始褪绿及叶边缘卷曲等番茄褪绿病毒感病症状(图1d)。对室内接种30d后的桂花进行RT-PCR鉴定(图,接种的20株桂花中有11株被鉴定为ToCV阳性,染毒率为55%。将PCR产物纯化回收后,连接到克隆载体,转化大肠杆菌后,每个样本取3个克隆送公司进行测序。结果显示RT-PCR扩增结果为439bp,在NCBI上进行BLAST比对,结果显示与KC887999.1的同源性为99%。初步验证了ToCV对桂花的侵染性。本研究在湖南省蔬菜研究所基地桂花种植区采集叶片,利用RT-PCR方法检测疑似发病叶片,经序列分析比对,确认ToCV侵染桂花,这是ToCV侵染桂花的首次发现。
　　3、南京桂花树价格:多种植物病毒常侵染田间作物
　　自然条件下,多种植物病毒的复合侵染在田间作物上常有发生,很多重要的病毒病害也是多种病毒相互作用共同侵染导致的。这些田间采集的桂花样品中,不排除其他病毒病原的存在,这也是导致室内接种ToCV的症状与田间症状有所出入的主要原因。
　　4、南京桂花树价格:这也是室内接种与田间症状不一致的原因
　　此外,田间发病植株的带毒量较高,而室内接毒的病毒量较低,这也是造成室内接种与田间症状不符的原因。在ToCV阳性的37份样品中,有2份无明显症状,表明桂花显症可能与ToCV的积累量或者浓度有关,或存在部分潜隐性侵染。ToCV在湖南桂花样品的检出率高达65%,这一较高的发病率,一方面对于桂花种植存在威胁;另一方面由于ToCV可以通过烟粉虱传播,对其他经济作物造成潜在威胁。这与先前的报道一致。因此,对烟粉虱的监测有利于预防和控制该病毒的发生,减少其带来的危害。
　　5、南京桂花树价格:番茄黄化病毒还可侵染13属30种
　　番茄褪绿病毒具有多种寄主,除感染番茄、辣椒、马铃薯和其他茄科植物外,还可感染13属30种植物。本研究发现的新寄主桂花,在农业上设施栽培面积较大,番茄褪绿病毒病一旦暴发,将导致桂花品质变差、产量下降,造成的经济损失严重影响农户的种植积极性。此外,在室内对桂花接毒的过程中发现,在病毒侵染后,桂花表现症状较晚,而在表现症状之前已经能够检测到病毒,这提醒我们在田间桂花可以保存番茄褪绿病毒的毒源,不容易被发现,且更容易造成番茄褪绿病毒在其他寄主上的扩散,应该重视在桂花上对番茄褪绿病毒病的提前检测。生产上对番茄褪绿病毒的防治应采取联防联控、综合防治。田间考察发现病毒病对桂花栽培品种的危害很严重,但目前尚未有根治病毒病的有效方法,病毒病的防治主要还是以预防为主。因此,本研究对于ToCV的预防和防治具有重要意义。
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