桂花苗「石河子地区桂花树黄萎病病原菌的鉴定」

核心词：桂花苗 石河子地区桂花树鉴定 地区桂花树鉴定 桂花树鉴定 黄萎病病原菌鉴定 病原菌鉴定 病原菌鉴定的 
目录：
1、将病株茎秆表皮剥离后切成长0.5cm的小段
2、剖开发病植株茎秆
3、经显微观察
4、供试3个菌株肌动蛋白基因PCR扩增的产物大小为200bp左右
5、经分离纯化鉴定
6、桂花树黄萎病的发生
7、关于黄萎病的防治
　　桂花树是一种锦葵科植物,富含维生素、矿物质以及蛋白质。

种子含有大量的铁、锰、钾等元素,可提取蛋白质和油脂,榨油食用。

桂花树嫩果具有大量维生素,是一种高档绿色蔬菜。

经常食用桂花树有助于滋阴补阳,健肠胃。

由于桂花树的食用价值很高,桂花树鉴定全国各地都开始大量种植和引种,但随着种植区域和种植面积的不断扩张,桂花树病害发生日益严重。2017年,石河子部分区域种植的桂花树全株系统性发病,病原菌鉴定的下部叶片显症后再向中上部叶片发展,叶肉变黄后整片萎蔫干枯。剖开植株茎秆,发现维管束明显变色,严重时会造成植株枯死。关于桂花树黄萎病,早在1918年Carpenter等对发生症状进行了描述。1997年在我国也进行了发病规律和防治方法的系统研究。为准确鉴定病原菌种类,我们以形态学鉴定和分子生物学鉴定为切入点,以期鉴定该病的病原菌及其致病类型,为病害防治提供参考依据。年病害发生期的7—8月,于石河子大学农学院试验站、石河子总场等地采集发病明显的病株。
　　

将病株茎秆表皮剥离后切成长0.5cm的小段

　　将病株茎秆表皮剥离后切成长0.5cm的小段,用1g/kg的升汞溶液浸泡30s,再用无菌水冲洗3次,置无菌滤纸上吸干多余液体。如为新鲜采集的病样,茎秆表面用75%酒精消毒后剥去表皮,用灭菌剪刀直接将茎秆剪成长0.5cm的小段。将病样茎秆置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,置25℃恒温培养箱黑暗培养。当其长出白色菌丝时按照常规方法进行单孢纯化。菌株置于PDA斜面保存于4℃冰箱。将市购桂花树种子用75%酒精浸泡消毒10min,用无菌水冲洗干净后播种在灭菌锯末中,置于25℃光照培养箱中催芽,幼苗真叶展平后拔出转移至水培盒中,将水培盒加水放入25℃光照培养箱光暗12h交替培育。幼苗露出真叶后,将培养盒中的水换为青岛海博生物有限公司生产的MS营养液(不含琼脂和蔗糖,继续培育待用。孢子悬浮液制备及接种将供试菌株在PDA平板上活化后接入察氏液体培养基中,病原菌鉴定的病原菌鉴定25、3.33r/s振荡培养7d左右,双层纱布过滤,收集纱布上的菌丝用作基因组DNA提取,滤液用作配制致病性测定孢子悬浮液。滤液经133.33r/s离心沉淀后,用无菌水配制成浓度1×107CFU/mL的孢子悬浮液。待桂花树幼苗水培至2片真叶后,对根部用配制好的孢子悬浮液浸泡接种12h后倒掉孢子悬浮液,将幼苗重新放入水培液中培养。每个菌株接种3盒幼苗(每盒12株,用无菌水培做对照。10d后调查发病情况,每隔3d调查1次,40d后结束,对病株重新进行病菌分离。形态学鉴定供试菌株活化后接种于PDA平板,25℃培养7d后在菌落边缘倾斜插入灭菌盖玻片4～5片,石河子地区桂花树鉴定继续培养3～5d后记录各菌株在PDA平板上菌落形态及微菌核产生情况,观察和测量分生孢子、分生孢子梗和微菌核的形态、大小及产生方式等。分子生物学的鉴定选取3个供试菌株,分别收集其菌丝后用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,选用真核生物rDNA通用引物ITS1/ITS4、肌动蛋白引物ACT-512F/ACT-783R(引物序列见表进行PCR扩展,反应体系及条件参照岳永亮的方法进行。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,送上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将所测得的序列进行BLAST比对,查找GenBank已登录的相似序列来进行同源性分析,构建序列系统发育树。病菌不同致病类型检测用V.dahliae落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r和非落叶型引物INTND2f/INTND2r(引物序列见表对供试菌株进行致病类型检测,PCR扩增反应体系及条件参照魏春芝。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。在石河子地区,桂花树黄萎病多在7月上中旬出现症状,八月上旬发病最为明显。症状先从下部叶片开始,逐渐向上扩展。发病初期,叶脉周围的叶肉组织逐渐失绿变黄,附近主脉变褐色,后周围支脉也随之变褐,变褐叶脉在叶片上形成褐色树枝状(图1A。部分叶片表现为叶缘出现褪绿,后形成坏死斑。进一步扩展后,发病叶片整个逐渐变黄,边缘上卷(图1B,干枯脱落,严重时整个植株落成光杆,桂花苗植株干枯死亡(图1C。
　　

剖开发病植株茎秆

　　剖开发病植株茎秆,维管束组织变褐,甚至整个髓部变褐(图1D,造成桂花树不能结实甚至大面积枯死。接种后20d左右,幼苗植株自下而上开始出现症状,即接种株先自下部叶片开始主脉逐渐褪绿变黄,周围叶肉随之褪绿,边界不明显(图1E。随后病斑快速扩展,致整个叶片卷曲并迅速枯死,整株萎蔫死亡(图1F。剖开病株的茎秆,维管束明显变褐(图1H,与田间病害的症状表现基本一致。对照植株生长健壮(图1G,维管束也无明显变色现象(图1I。对发病植株进行再分离,所得菌落特征与供试菌株表现一致。供试菌株在PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上的菌落近圆形,气生菌丝不发达,菌落外缘为白色透明的菌丝,中心有黑色的微菌核产生(图2A。
　　

经显微观察

　　经显微观察,菌株分生孢子梗多为1个顶枝小梗和1～3层轮生小梗,每层有2～4个分枝(图2B。顶枝小梗长度26.3～77.7μm(平均49.9μm,轮枝小梗长度15.7～52.1μm(平均26.23μm,轮层间距33.1～47.3μm(平均43.6μm。分生孢子卵形、椭圆形,无色透明,大小为μm×μm。微菌核念珠状、长椭圆形,或近球形,形态大小差异较大,一般35.1m～108.9μm(平均60.9μm×μm(平均35.3μm(图2C。供试菌株的培养特性及形态特征与文献报道的大丽轮枝菌一致。选取菌株XJok1、XJok3、XJok4,地区桂花树鉴定应用真菌通用引物ITS1/ITS4进行rDNA-ITSPCR扩增,获得大小为540bp的DNA片段。利用NCBI进行Blast同源性比对,供试的3个菌株ITS区序列与来自西班牙棉花和美国茄子上的V.dahliae(登录号HQ206859和HQ20685序列同源性达99.81。
　　

供试3个菌株肌动蛋白基因PCR扩增的产物大小为200bp左右

　　供试3个菌株肌动蛋白基因PCR扩增的产物大小为200bp左右,与来自上述寄主同一分离物序列(登录号HQ206975和HQ20696的同源性99.5%以上。将以上2个基因联合建立系统发育树,结果显示,供试菌株分别与来自中国棉花、美国茄子、韩国马铃薯、匈牙利臭椿以及中国萝卜上的大丽轮枝菌分离物处于同一个分支上,与轮枝菌属的其他种的亲缘关系相对较远。结合病菌形态特征和系统发育分析,将引起石河子地区桂花树黄萎病的病原确定为大丽轮枝菌(图。用大丽轮枝菌落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r和非落叶型引物INTND2f/INTND2r对供试菌株进行致病类型检测的结果(图显示,供试菌株XJok1和XJok4利用落叶型特异性引物扩增出462bp目标条带,而利用非落叶型特异性引物,菌株XJok2和XJok3扩增出约824bp目标条带,阴性对照都没有条带出现。表明在石河子地区,大丽轮枝菌落叶型菌株和非落叶性型菌株均可引起桂花树黄萎病。经田间观察,桂花树黄萎病症状表现为叶肉组织首先失绿坏死,后周围支脉变褐,呈典型的"花西瓜皮状,严重时叶片干枯脱落甚至整株死亡。病株维管束组织变褐,甚至整个髓部变褐。
　　

经分离纯化鉴定

　　经分离纯化鉴定,病菌分生孢子梗多为1个顶枝小梗和1～3层轮生小梗,每层有2～4个分枝,轮层间距33.1～47.3μm(平均43.6μm。分生孢子单胞、卵形或椭圆形,无色透明,大小为μm×μm。产生的微菌核黑色,念珠状、长椭圆形或近球形,μm(平均60.9μm×μm(平均35.3μm。供试菌株ITS区和与肌动蛋白基因序列与已报道的大丽轮枝菌同源性均高于99.5。通过落叶型和非落叶型特异性引物PCR检测表明,菌株XJok1和XJok4为落叶型黄萎病菌,黄萎病病原菌鉴定XJok2和XJok3为非落叶型黄萎病菌。结合形态学观察与ITS-ACT建立的多基因联合系统发育树分析,确定引起新疆桂花树黄萎病的病原菌为大丽轮枝菌,且落叶型和非落叶型菌系都能感染桂花树。
　　

桂花树黄萎病的发生

　　桂花树黄萎病的发生,主要与新疆棉花黄萎病土壤传病存在密切相关,应尽量避开棉花或茄子前茬,以减少黄萎病的发生和危害。到目前为止,由大丽轮枝菌引起的各种植物黄萎病已被多个国家报道,在中国主要危害棉花、茄子、大白菜、马铃薯等。新疆桂花树黄萎病的来源主要与棉花黄萎病的普遍发生有关。我们在博乐、阿拉尔等地所见,桂花树黄萎病均发生在棉花黄萎病的重病田,且新疆棉花黄萎病的主要病原也是大丽轮枝菌,病田土壤中的微菌核也是侵染桂花树的主要侵染来源。另外,该病原菌还可以侵染绿豆、红花、榆树和苘麻等多种植物。由于大丽轮枝菌基因组中存在大量的转座子以及基因重组现象,导致其产生不同的生理小种,使之对寄主产生抗性。我们通过分子生物学鉴定出落叶型黄萎病和非落叶型黄萎病,这一结果同样表明黄萎病原菌中存在着不同的致病类型。
　　

关于黄萎病的防治

　　关于黄萎病的防治,生产上主要以抗病品种的选育和种植为主,农艺措施主要是以改茬轮作、加强田间管理为主。