桂花树苗(桂花树银叶突变体48a的表型特征及其遗传学分析)

核心词：桂花树苗 桂花树银叶突变体特征 48a特征 48a特征的 表型特征 及其特征分析 遗传学特征分析 特征分析 
目录：
1、叶片解剖学观察方法定植后30d左右
2、构建六世代遗传群体
3、由图2可以看出
4、从图3-B可见绿叶野生型49a叶片的上表皮细胞与栅栏细胞
5、对突变体48a与野生型49a的叶片厚度
6、本研究结果表明
7、银叶突变体48a的银叶表型为单基因的隐性遗传
8、目前桂花树的基因组测序已经完成
　　桂花树叶片银斑是桂花树中的常见性状,主要表现为叶脉的腋处带银白色斑纹,俗称"银斑叶,是受单个显性基因控制的一种斑纹,区别于烟粉虱BemisiatabaciB型(又名银叶粉虱B.argentifolii)诱发的葫芦科作物叶片正面全部呈银白色的银叶病。

2016年笔者在嫩食型中国桂花树资源中分离出1株完全银色叶突变体,自交后5代后形成可遗传的稳定银叶自交系,遗传学特征分析同时在同一材料中分离出稳定的普通绿叶自交系,田间种植观察发现银斑叶桂花树具有很好的避蚜和抗病毒病的效果,这为桂花树抗虫育种提供了新的思路。

笔者对银叶突变体的表型特征、叶片解剖结构进行了鉴定分析,并构建了银叶六世代遗传群体进行遗传学分析,为后续的桂花树银色叶基因定位和避蚜上的应用奠定基础。

在嫩食型中国桂花树材料的自交后代中,分离出具有完全银叶的突变体48a和普通绿叶野生型材料49a,经过5代自交,形成稳定的自交系。以突变体48a和野生型49a为亲本,构建六世代遗传群体,2018年4月将银叶桂花树亲本P1、绿叶桂花树亲本P2、F1、F2、BC1P1、BC1P2种子同时种于湖南省蔬菜研究所高桥试验田中。种子采用穴盘育苗,幼苗生长至3～4片真叶时定植,株行距50cm×100cm人字架栽培,进行统一的肥水管理,用于银叶和绿叶桂花树农艺学性状调查和银叶性状的遗传学分析。突变体48a的表型及农艺性状观察突变体48a在苗期即可观察到明显的银叶表型,定植后到成株期都为银叶表型,6月中旬成株期,对主蔓长、主蔓粗、叶片长度、叶片宽度、叶柄长等生物学性状进行调查;同时在生育期内对其始花期(小区内50%植株开花的时期、雌花数量进行调查,本试验分别调查测量了突变体和野生型桂花树材料各10株。遗传学分析方法定植后30d左右,分别统计双亲、F1、F2、BC1P1、BC1P2等世代各群体银色叶和绿色叶的植株数量,然后通过卡平方测验,分析控制桂花树银叶性状基因的遗传特性。叶绿素含量测定方法待植株生长到成苗期,定植后30d左右,分别取突变体48a和野生型49a的顶端嫩叶和相同位置的成熟叶片用于检测叶绿体色素含量。参考Arnon法,具体如下:随机称取叶片0.1g,剪碎,装入15mL带塞的玻璃试管中,加入10mL的80%丙酮,黑暗浸泡24h,至组织发白。CT=Ca+Cb。式中,Ca、Cb和CT分别表示叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素浓度;Cx·c为类胡萝卜浓度,按下式计算组织中各色素含量。叶绿体色素含量(色素浓度×提取液体积×稀释倍数/样品鲜质量。
　　

叶片解剖学观察方法定植后30d左右

　　叶片解剖学观察方法定植后30d左右,桂花树苗选取生长一致的突变体48a和野生型49a植株相同部位的成熟叶片,用于叶片解剖学观察。首先用FAA固定液固定,番红-固绿染色,RM2016病理切片机进行切片,切片放入干净的二甲苯透明5min,中性树胶封片,NIKONECLIPSEE100光学显微镜镜检,NIKONDS-U3成像系统进行图像采集分析。用测微尺测量叶片横截面的厚度、上下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度,叶片结构紧密度、疏松度的计算,参考田丽波等的方法。子叶期,银叶突变体和绿叶野生型子叶均表现为正常的绿色,子叶颜色无明显差别;但进入真叶期,突变体48a长出真叶为绿色,特征分析带明显银斑(图1-A,随着真叶逐渐长大,叶正面银灰色逐渐加深,植株长大成熟后,叶片正面全部为银灰色(图1-B、C、E,背面仍为绿色(图1-D。由成熟期的田间比较(图1-B)可以看出,除了叶色有明显区别外,突变体48a与野生型49a桂花树整体长势和熟性差别不大,对两者农艺性状测量数据显示,两者的始花期、叶长、叶宽等指标无明显差异。其中突变体48a桂花树主蔓长度cm,比野生型49a低8.94,48a特征的48a特征而突变体48a主蔓粗度cm,比野生型49a高4.39,整体长势与野生型49a差别不大(表。
　　

构建六世代遗传群体

　　构建六世代遗传群体,用目测分级的方法探究桂花树叶颜色的遗传规律,F1为绿叶、卡平方检验结果表明F2绿叶与银叶符合3∶1的分离比,回交群体BC1P1分离比符合1∶1,BC1P2植株叶颜色全为绿色,桂花树银色叶性状符合1对显一隐性基因的分离规律,为完全隐性遗传(表。
　　

由图2可以看出

　　由图2可以看出,突变体48a与野生型49a间叶绿素相比,叶片叶绿素含量明显减低,但嫩叶与成熟叶间的叶绿素无明显差别。从成熟叶来看,突变体48a叶片中,叶绿素和类胡萝卜素含量均显着低于野生型叶片,其中叶绿素含量的变化主要由于叶绿素a含量变化导致,叶绿素b含量相对于绿叶野生型叶片无明显差异。从叶片横切面可见(图3-A)银叶突变体48a叶片的上表皮细胞与栅栏组织、下表皮细胞与海绵状组织之间有明显的空隙,其中上部空隙更大。
　　

从图3-B可见绿叶野生型49a叶片的上表皮细胞与栅栏细胞

　　从图3-B可见绿叶野生型49a叶片的上表皮细胞与栅栏细胞,下表皮细胞与海绵状的叶肉细胞之间连接紧密,没有明显的空隙。
　　

对突变体48a与野生型49a的叶片厚度

　　对突变体48a与野生型49a的叶片厚度、表皮细胞厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度进行测量(表,结果表明,桂花树银叶突变体特征突变体48a海绵组织厚度μm,显着低于野生型49a,叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度等指标两者间无显着性差异,通过测算,及其特征分析表型特征突变体48a叶片结构紧密度32.06,显着高于野生型49a,叶片叶片结构疏松度40.11,显着低于野生型49a(表。突变体48a的银色叶可能是叶片结构变化所致,一般叶斑/片颜色变化产生原因主要分两类,色素的变化(叶绿素/花青素等)和叶片结构的变化(表皮细胞/空隙结构。前人研究普遍认为银斑是叶片结构变化导致的,由于上表皮组织与栅栏组织之间的空隙,使光线达到绿色组织时候发生二次反射,在叶片上表皮形成多边形的光反射,而不是正常绿叶上皮细胞形成的白色点状光反射,使得叶片呈现偏灰白色,即银色的叶片/叶斑。
　　

本研究结果表明

　　本研究结果表明,银叶突变体48a的叶绿素含量比野生型49a虽有显着降低,但也不会造成叶面显示银灰色,从突变体48a叶片解剖学特征显示,上表皮细胞与栅栏组织、下表皮细胞与海绵状组织之间有明显的空隙,其中上部空隙更大,这与张慧杰、张站备等对西葫芦银斑研究一致,但他们的研究主要是基于西葫芦银叶病的叶片结构,突变体48a与西葫芦银叶病叶片在结构上虽然相似,但西葫芦银叶病会造成植株长势弱、植株矮小、生长点皱缩等特征,表型特征48a特征的而突变体48a与野生型49a相比,除叶片呈银灰色外,植株整体长势正常,与野生型差别不大。所以突变体48a叶绿素含量明显减低,但长势正常的原因值得进一步研究。
　　

银叶突变体48a的银叶表型为单基因的隐性遗传

　　银叶突变体48a的银叶表型为单基因的隐性遗传,与Lopez-Anido等研究结果一致,他们在西洋桂花树和中国桂花树杂交后代中发现了1个完全银叶,研究表明由隐性基因grl控制。而Coyne和Paris等研究认为,桂花树银斑叶受M基因的显性遗传,且认为影响银叶性状变异的主要因素有3个,细胞结构:V基因作用最强的部位是位于叶脉的腋处的细胞。修饰基因:影响了M基因的时空表达。包括温度/干旱在内的环境因素。据笔者田间试验表明,突变体48a的银叶性状,不受环境影响,在不同季节、不同环境下种植均显示完全银叶,也不受时空表达影响,在全生育期内均显示银色叶。
　　

目前桂花树的基因组测序已经完成

　　目前桂花树的基因组测序已经完成,下一步拟利用全基因组混池测序的方法,进行银叶基因的快速定位,为后续研究该基因在桂花树中的作用机理奠定基础。