桂花树苗「甜桂花 B类MADS-box基因的分离与序列分析」

核心词：桂花树苗 甜桂花基因分离分析 B类MADSbox基因分离分析 MADSbox基因分离分析 基因分离分析 基因分离分析的 分离分析 与分离分析序列 分离分析序列 
目录：
1、基因克隆所用材料为雌蕊分化后期的花芽
2、选择花同源MADS-box基因的4个亚家族中的典型MADS-box基因
3、半定量RT-PCR分析表明
4、同源性分析表明
5、已有研究中
　　甜桂花在栽培过程中如在花芽分化期和花期遭遇高温,会使花粉发育畸形,进而影响坐果。

由于甜桂花花具有完整的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊4轮结构,我们采用RT-PCR和RACE方法,从甜桂花中分离控制其雄蕊发育的B类MADS-box基因,并对其进行表达特征研究,为了解甜桂花雄蕊异常的分子机理以及MADS-box基因在雄蕊发育中的调控作用奠定基础。

甜桂花品种为6a生拉宾斯,定植在中国农业科学院郑州果树研究所试验园内。

　　

基因克隆所用材料为雌蕊分化后期的花芽

　　基因克隆所用材料为雌蕊分化后期的花芽。

组织特异性表达分析所用的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊取自拉宾斯盛花期花朵。

所有材料均用液氮处理-80℃冻存备用。用改良CTAB法提取花芽RNA,用cDNAsynthesiskit合成cDNA,基因分离分析按照kit说明书进行。根据多种植物MADS-box基因核酸保守区,设计PCR引物扩增。PaMADS2上游引物为:5-TATCCACTTCATTGCTGAGGTTC-3;PaMADS2下游引物为:5-CAACAGCAGGTCACTTACTCTA-3。PCR反应体系为25μL,循环参数为:94℃10min;94℃30s;55℃30s;72℃1min;34cycles。回收目的片段克隆到pMD19-T载体上,转入大肠杆菌DH5ａ菌株,测序及序列分析。使用clontechRACEkit进行5’RACE和3’RACE,PaMADS2的3’RACE引物序列为:5-GGAGAGTGGAGCTGAAGAGG-3;5’RACE引物序列为5-GTGGCTCTTTCGCTGAAGAT-3,按kit说明书进行操作,回收扩增产物,克隆到pMD19-T载体上,转入大肠杆菌DH5ａ菌株,进行蓝白斑筛选后进行双向测序、拼接分别得到PaMADS2基因全长。通过NCBI中Blastx对PaMADS2进行同源性搜索和比对,利用ClustalX软件进行同源性分析,使用MEGA软件NJ法构建系统发育树。提取盛花期萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊总RNA,cDNAsynthesiskit合成cDNA,半定量分析所用引物与克隆片段引物相同。对雌蕊分化后期的花芽进行PCR扩增,与分离分析序列分离分析分离出233bp中间片段,在NCBI上Blast比对测序,结果表明该片段与多种植物的MADS-box基因有较高的同源性,证明该片段为所需的目的片段。采用RACE技术,分别获得3’端和5’端目的片段,序列拼接得到962bp的基因全长,命名为PaMADS2,GenBank的登录号为HQ229606。PaMADS2基因含有1个633bp的开放阅读框,编码210个氨基酸(图,分子量24.5ku,等电点8.72,是一个碱性蛋白。利用NCBI中的Blastx工具把PaMADS2核酸序列翻译为氨基酸序列,与其他植物的PI-likeMADS-box蛋白比对,分离分析基因分离分析的结果表明,PaMADS2与ABC模型中的B类基因有较高的同源性,分离分析序列含有一个保守的MADS区和半保守的K区(图,其中与桃PrpMADS10的同源性为97,与苹果MdPI的同源性为86,与金鱼草GLO的同源性为63,甜桂花基因分离分析与拟南芥PI的同源性为57。
　　

选择花同源MADS-box基因的4个亚家族中的典型MADS-box基因

　　选择花同源MADS-box基因的4个亚家族中的典型MADS-box基因,利用MEGA软件,构建系统进化树(图。系统进化关系分析表明:PaMADS2基因编码蛋白与ABC模型中的AP3/PI-like基因编码蛋白同源性较高,其中与桃中的PpMADS10基因编码蛋白亲缘关系最近,所以把PaMADS2基因归于AP3/PI基因亚家族。
　　

半定量RT-PCR分析表明

　　半定量RT-PCR分析表明,PaMADS2基因在花瓣和雄蕊中表达,在萼片和心皮中不表达,这与同源性较高的拟南芥的PI基因的组织表达情况一致,分离分析序列与分离分析序列进一步说明其应属于B类基因(图。目前已经分离出大量木本植物的B类MADS-box基因,B类MADS-box基因影响雄蕊的正常发育,但调控这些性状的分子遗传机制尚不十分清楚。本试验根据MADS-box基因在M区高度保守的特征,在NCBI上搜索不同物种的MADS-box基因并进行核酸、蛋白比对以及系统进化分析,设计同源特异性引物,桂花树苗利用RT-PCR和RACE技术,我们克隆得到一个PaMADS2基因,MADSbox基因分离分析该基因具有完成的ORF以及3-UTR和5-UTR,推断的蛋白质具有完整的M区和K区。在基因表达上,PaMADS2在甜桂花花器官的第2轮和第3轮表达,而在第1轮和第4轮不表达,这与拟南芥的PI基因表达模式一致;从系统进化分析来看,其与桃的PpMADS10、苹果的MdPI基因亲缘关系最近,所以我们推测其应属于B类MADS-box基因家族成员。
　　

同源性分析表明

　　同源性分析表明,PaMADS2与李属的桃PpMADS10和苹果的MdPI基因高度同源;苹果MdPI基因能够调控其雄蕊发育,其突变体在不授粉时由于其自身突变的MdPI不能正常表达而形成无核果实。温度可影响苹果MdPI的表达,当MdPI转拟南芥PI突变体后,培养温度变化可使F2代出现轻微的花器官同源异型转换,而温度是怎样调控基因表达的尚不清楚。
　　

已有研究中

　　已有研究中,B类MADSbox基因分离分析温度使植物体内的赤霉素水平发生变化,而赤霉素信号转导过程中的某些调控因子可能影响MADS-box基因的表达,所以温度通过怎样的途径影响MADS-box基因的表达,有待进一步研究。温度可调控MADS-box基因的表达,雌雄性器官发育对温度的要求也不同,PaMADS2在不同温度时雄蕊中的表达状况我们将在后续的试验中完成,以期了解PaMADS2的生物功能以及可能的调控途径。