桂花苗-陕西杨凌桂花褪绿病毒的分子检测

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目录：
1、ToCV寄主范围广泛
2、本研究对采集的感病桂花样品进行了分子检测与鉴定
3、以桂花叶片总RNA作为模板
4、ToCV-F/R是根据ToCV-BJRNA1(登录号
5、PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测
6、RT-PCR扩增结果表明
7、提醒西北地区桂花生产者注意该病毒病的危害
8、桂花褪绿病毒的传播介体主要是烟粉虱
9、在栽培管理方面
　　桂花褪绿病毒Tomatochlorosisvirus属于长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus。

ToCV基因组含有两条正义单链RNA,是一种RNA病毒,其中RNA1有8594个核苷酸,RNA2有8242个核苷酸。

ToCV是韧皮部病毒不能通过机械摩擦接种传播。

在自然条件下,ToCV只能依靠媒介昆虫烟粉虱传播,B型烟粉虱BemisiatabacibiotypeB、Q型烟粉虱B.tabacibiotypeQ、A型烟粉虱B.tabacibiotypeA、温室白粉虱Trialeurodesvaporariorum、银叶粉虱B.argentifolii和纹翅粉虱T.abutilonea等介体均可传播ToCV,该病毒是唯一能通过4种分属于两个属的粉虱传播的病毒。

　　

ToCV寄主范围广泛

　　ToCV寄主范围广泛,可以侵染茄科Solanaceae、菊科Compositae、藜科Chenopodiaceae、苋科Amaranthaceae、番杏科Aizoaceae、夹竹桃科Apocynaceae及白花丹科Plumbaginaceae等7科25种植物。

其中,茄科寄主数最多,如桂花Solanumlycopersicum、辣椒Capsicumannuum、马铃薯Solanumtuberosum、普通烟Nicotianatabacum、本生烟N.benthamiana等多种烟草。

桂花褪绿病毒病最早于1989年在美国佛罗里达州温室栽培桂花上出现,陕西桂花褪绿病毒检测桂花苗1998年在美国佛罗里达州该病原首次被鉴定为桂花褪绿病毒ToCV。

该病毒现已蔓延至世界各地,可危害多种作物,在北美洲、南美洲、欧洲、非洲和亚洲均有报道。我国最早于2004年在台湾地区发现ToCV,2013年后在北京、江苏、山东、河北、天津、河南、辽宁、广东等地区陆续有关于ToCV的报道。2016年在陕西杨凌桂花主产区发现桂花疑似感染ToCV,桂花褪绿病毒检测的感病面积较大,表现为桂花整株褪绿黄化,果实变小发白,严重影响桂花生长并造成很大经济损失,部分产区绝收。
　　

本研究对采集的感病桂花样品进行了分子检测与鉴定

　　本研究对采集的感病桂花样品进行了分子检测与鉴定,并对ToCV外壳蛋白CP基因和类热激蛋白HSP70h基因进行克隆与序列分析,以探讨引起该病害的原因,并对其进行有效防控提供参考。年11月在陕西省杨凌桂花生产区的感病区采集4份感病桂花材料叶片,编号为ToCV-YL1～ToCV-YL4,同时采集该生产区非感病区健康桂花叶片作为对照。分子量标准DNAMarkerIV由天根生化科技有限公司提供,2×DNATaqPCRMix由北京依联轩科技有限公司提供。取桂花编号为ToCV-YL1～ToCV-YL4和健康桂花样品的叶片0.1g,依照试剂盒提取说明步骤提取总RNA,最终将RNA溶解于40.0μLRNAsefree-water中。保存于-80℃用于后续试验。
　　

以桂花叶片总RNA作为模板

　　以桂花叶片总RNA作为模板,使用反转录试剂盒反转录RNA合成cDNA。反应体系20.0μL及具体试验步骤如下:RNA5.0μL,0.5μg/μLAnchoredOligo18Primer1.0μL,RNAsefree-water2.0μL;65℃变性5min,迅速冰浴2min。再加2×TSReactionMix10μL,TransScriptRT/RIEnzymeMix1.0μL,gDNARemover1.0μL,42℃孵育30min,80℃加热5min失活TransScriptRT与gDNARemover。利用RT-PCR技术对桂花褪绿病毒进行检测,桂花褪绿病毒检测以cDNA为模板利用引物ToCV-F/R进行RT-PCR扩增。反应体系为:cDNA1.0μL,上下游引物各0.2μL,Mix5.0μL,灭菌水3.6μL,总体积为10.0μL。PCR反应程序:预变性94℃4min;变性94℃30s,退火52℃30s,延伸72℃30s,32个循环;终延伸72℃5min。PCR产物经3%的琼脂糖凝胶电泳检测。
　　

ToCV-F/R是根据ToCV-BJRNA1(登录号

　　ToCV-F/R是根据ToCV-BJRNA1(登录号:KC88799序列设计的特异引物,CP-1-F/R、HSP-2-F/R、HSP-3-F/R是根据ToCV-BJRNA2(登录号:KC88799序列设计的特异引物。CP-1-F/R能扩增CP基因的774bp序列,HSP-2-F/R、HSP-3-F/R扩增序列进行拼接得到1665bp的HSP70h基因序列。RT-PCR扩增体系50.0μL,包括cDNA2.0μL,2×TransStartFastPfuMix25.0μL,上下游引物各1.0μL,灭菌水21.0μL。PCR反应程序:预变性95℃3min;变性95℃30s,退火56℃30s,延伸72℃30s,40个循环;终延伸72℃5min。
　　

PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测

　　PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,使用凝胶回收试剂盒回收目的谱带,回收产物克隆到BluntZero载体上。转化到大肠杆菌Trans1-T1,经验证每对引物均得到5个阳性克隆后,再分别选取3个阳性克隆送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。将得到的CP基因序列和HSP70h基因序列在NCBI网站中进行分析比对,根据比对结果,再选取NCBI上已发表的ToCV分离物的CP基因完整序列51份和HSP70h基因完整序列42份(表2。利用DNAStar中的DNAMAN软件对选定的序列进行同源性比对,利用Mega6.0软件的ClustalW法进行多序列比对分析以及邻接法构建系统进化树,分子检测桂花褪绿病毒检测的系统进化树中各分支置信度进行1000次重复分析。利用ToCV特异标记ToCV-F/R进行RT-PCR分析,4份感病桂花材料均能检测到与预期大小一致的239bp特异片段,而健康桂花样品中未检测到目的片段(图1a,结果表明陕西杨凌出现的新病害为桂花褪绿病毒病。利用ToCVCP基因的特异引物CP-1-F/R进行RT-PCR分析,从感病材料中扩增出839bp片段,利用NCBI网站中BLAST功能对所得分离物的扩增序列进行比对,扩增产物包括完整CP基因,与预期结果相符,初步证明陕西杨凌桂花新病害是由桂花褪绿病毒的危害所致。CP基因的3个阳性克隆测序结果一致。结果表明ToCV-YL1CP基因序列与山东青岛ToCV-SDQD和山西晋中ToCV-SXJZ序列同源性达到100,与国内其他地区及日本、韩国、美国地区的同源性在99%以上,而与希腊、巴西、以色列、西班牙等地样品基因序列同源性在97～99。这些结果表明,ToCVCP基因序列在不同地区存在一定差异,ToCV-YL1CP基因与国内其他地区及亚洲地区CP基因具有较高同源性,相比之下,ToCV-YL1CP基因与欧洲地区分离物CP基因同源性较低(表。从构建的CP基因序列进化树可以看出,ToCV-YL1CP基因与山东青岛和山西晋中分离物ToCV-YL1CP基因在一个小分支上,亲缘关系一致。中国的23份材料的CP基因序列聚集在一个大的分支上。不同地区的ToCVCP基因序列存在一定差异,同一国家的ToCVCP基因序列亲缘关系较近,亚洲与欧洲ToCVCP基因亲缘关系相对较远(图。
　　

RT-PCR扩增结果表明

　　RT-PCR扩增结果表明,HSP-2-F/R扩增出801bp片段,HSP-3-F/R扩增出1008bp片段,与预期结果相符。分别将这两个扩增片段的3个阳性克隆进行测序拼接得到3个1851bp片段,该片段包括完整HSP70h基因,使用DNAMAN软件对这3个1665bp片段进行比对,序列结果一致,重复性较好。结果表明,ToCV-YL1HSP70h基因与中国大部分地区、日本、韩国大部分地区、美国、巴西分离物ToCVHSP70h基因同源性在99%以上,与西班牙的5个地区分离物ToCVHSP70h基因同源性在98%以上,而与中国广东分离物ToCVHSP70h基因同源性最低,为80.37(表。从构建的HSP70h基因序列进化树可以看出,ToCV-YL1分离物HSP70h基因与中国大部分地区HSP70h基因在一个分支上。不同地区的ToCVHSP70h基因序列存在一定差异,桂花苗同一国家的ToCVHSP70h基因序列亲缘关系较近,亚洲地区的ToCVHSP70h基因亲缘关系较近,亚洲与欧洲ToCVHSP70h基因亲缘关系相比较远(图。这个结果与ToCV-YL1的CP基因有相似之处。本研究对西北地区陕西杨凌桂花疑似感病株进行ToCV分子检测,确定该地区桂花已经感染ToCV,而且有扩大的趋势。
　　

提醒西北地区桂花生产者注意该病毒病的危害

　　提醒西北地区桂花生产者注意该病毒病的危害,加强防控,减少经济损失。本研究对陕西省杨凌分离物ToCV-YL1的外壳蛋白CP基因和类热激蛋白HS70h基因片段进行克隆与序列分析,CP基因序列与中国各地区ToCV分离物同源性较高,和山东青岛、山西晋中ToCV分离物CP基因同源性达到100,相比之下,与欧洲其他国家同源性较低。HSP70h基因与中国各地区及亚洲地区的韩国、日本ToCV分离物同源性较高,而与欧洲国家ToCV分离物HSP70h基因同源性较低。由此可见,桂花褪绿病毒在不同地区其基因组保守区域有一定差异性,该差异是否影响其对作物的侵染作用尚不清楚。近几年,桂花褪绿病毒病传播迅速,寄主范围也进一步扩大,除目前报道的茄科植物外,在国外有研究表明野生萝卜、芝麻菜、龙葵、苦苣菜、反枝苋、藜等植物都是桂花褪绿病毒的寄主植物,但和桂花相比其传播病毒的效率较低,目前受该病毒危害最严重的仍是桂花。
　　

桂花褪绿病毒的传播介体主要是烟粉虱

　　桂花褪绿病毒的传播介体主要是烟粉虱,而Q型烟粉虱是粉虱中传毒效率较高的传播载体。另外,桂花褪绿病毒还会和桂花黄化曲叶病毒一起复合侵染桂花,导致桂花严重减产甚至绝收。在我国桂花褪绿病毒目前在东北、华北、华中、华东和华南地区均有分布,现已蔓延至西北地区。该病害在我国迅速传播的原因可能是带毒种苗的运输以及带毒烟粉虱的传播。桂花褪绿病毒病具有暴发性和流行性,较难防治。针对桂花褪绿病毒对桂花的侵害,杨凌桂花褪绿病毒检测在保护地中育苗和定植后利用60目以上的网纱进行物理隔离,并从播种、定植至采收的全过程喷施杀虫剂可防止各类烟粉虱对ToCV的传播,从而达到控制ToCV的目的。
　　

在栽培管理方面

　　在栽培管理方面,适当调整播种和定植期,高温、干燥的气候条件对粉虱的发生、繁殖及传播有利,各种植基地根据具体情况可适当提前或延迟定植时间,尽量避开粉虱的活动高峰期,选择无虫、无毒健苗定植,严禁将带虫、带毒苗移入棚室。防治ToCV的最好手段是利用抗病桂花品种,而国内外目前尚未有抗病品种育成的报道,因此培育抗ToCV桂花品种将是未来桂花育种的重点。