桂花CMV复制酶基因相对表达定量PCR方法的实现

　　为了确定在被桂花感染的CMV植物中CMV复制酶基因的表达水平，建立了定量检测CMV复制酶基因的相对表达的技术。以18S rRNA基因为对照，对桂花植株对CMV的抗性进行了鉴定。
　　CMV复制酶基因是目标基因，引物旨在探索SYBR Green实时定量PCR反应系统。行地，将CMV复制酶基因均质化，并使用荧光阈值（O值）计算p-防御素基因的相对表达。果表明：采用SYBR Green I实时定量PCR技术测定桂花CMV复制酶基因的相对表达具有较高的准确性，且耗时。技术可用于筛选抗CMV的植物。
　　花花叶病毒（Cucumeer，花叶病毒，CMV）属于溴moviridate家族的黄瓜花叶病毒属，是桂花病毒病的主要来源。的寄主范围很广，它可以感染来自85个科的365属的1000多种单子叶植物，主要​​依靠蚜虫传播病毒。前，使用常规化学试剂预防和治疗病毒性疾病的效果尚不明显。此，选择抗病毒疾病的品种是预防和控制疾病的非常有效的方法。
　　传统育种的抗性育种过程中，有必要根据表型和人工接种后的目视检查来鉴定抗病性，这不仅费时，费力而且费时。输效率低。问题。此，已经建立了确定CMV复制酶基因的相对表达的方法以有效和快速地筛选抗性靶植物。究抗性的分子机制也是必要的。时荧光定量PCR是近年来发展起来的一项新技术。结合了荧光共振能量转移和基于常规PCR的荧光标记探针，将核酸扩增，杂交，光谱分析和检测技术巧妙地结合在一起。时的。是一种创新技术，具有精确，简单，高灵敏度的特点，特别是定量低丰度的mRNA并揭示基因表达的微小变化。技术不需要进行扩增后电泳之类的处理，这样可以节省时间并有效去除实验室PCR产物（如核酸和溴化乙锭）中的污染物。时定量PCR技术已广泛应用于生物学，基础医学，法医学，诊断学等许多领域。研究方法以SYBR Green I实时定量PCR为基础，采用相对标准曲线法检测CMV复制酶基因的相对表达。桂花抗病性选择的新研究奠定技术基础。于接种的CMV是一种桂花花叶病毒植物的冻干粉，其购自福州腾龙生物有限公司，植物病毒研究所，福建农林。0.5 g冻干的CMV蔬菜粉，加入10 ml的0.03mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH = 7.0）匀浆并置于冰上直至使用。择该植物材料为桂花材料CMV HZL04-1，抗CMV F-3的桂花材料及其世代F2种群，并在轻型培养箱（20-25°C）中培养，获得189单株F2作为试验材料。桂花的叶子变成两片真叶子时，用清水洗净，待水干燥后，均匀撒上少量石英砂，并通过接种方法接种CMV。擦。种1分钟后，用水轻轻冲洗叶子。3天后，再次接种疫苗。共处理了189个样品用于后续实验。种前和感染CMV后，从桂花的叶片中提取总RNA，并使用RNA制剂制备总RNA提取试剂盒（TIANGEN）。遵循套件中的说明。18S烟草rRNA被用作内部参考基因，而CMV复制酶基因被用作目标基因。用Primer Express 3.0软件设计两对引物。列示于表1。物由上海圣工生物技术有限公司合成。用随机引物对cDNA进行反转录。PCR反应体系（20μL）如下：RNA2.0μL； RNA2.0μL。一链缓冲液（5 *）4.0μL; dNTP（2.5 mmolL-1）2.0微升；随机引物（10μM）2.0μL;赖氨酸（40 U·μL-1）0.5 uL; M-MLV（200U·uL-1）1.0 uL。反转录cDNA为模板，定量扩增靶基因（CMV复制酶基因）和内部参照基因（18S rRNA）。PCR反应系统为20μl，包括2×10μlSYBR Green Master Mix（ABI），0.4μl正向和反向引物（10umolL-1），1μlcDNA模板和20μl ul用消毒的去离子水。时PCR在Step One Plus实时PCR仪（ABI）上进行。应程序为95℃10分钟； 95°C持续15 s; 60°C 1分钟; 40个周期。解曲线程序如下：95℃15 s，60℃1 min; 60-90读取（每0.3读取一次信号）：90℃持续15 s。用cDNA作为模板，使用表1（图1）的18S引物和CMV引物通过定量实时PCR扩增样品。

　　
　　果显示参考基因和靶基因可以被很好地扩增，参考基因和靶基因的Ct值（图1A）为：融合曲线为单个峰，基线为平坦峰， Tm值（图1B）为78.51。75.55℃；在琼脂糖凝胶电泳中，取10μL扩增产物，在100 V电压下持续40分钟，结果（图1C）显示参考基因和靶基因已被扩增以获得预期的片段大小，而不是起动器二聚体生产严重。1A。增曲线：图1B。
　　合曲线：图1C.PCR产物的电泳。DNA标记M.DL2000; 1.内部参照基因的空白对照：2.目标基因的空白对照； 3.内部参考基因； 4.靶基因。

　　样品＃1的cDNA模板分别以100、20、4和0.8倍的4种梯度进行稀释，然后进行定量荧光实时PCR以建立标准曲线（图2）。部参考基因的R2为0.983；目标基因的R2为0.992，反应效率大于0.98，两者的反应效率相近，表明该系统可用于定量PCR系统。2A。部参考梯度的放大曲线：图2B。部参考标准曲线：图2C。标梯度放大曲线；图2D。标校准曲线。用样品＃1作为参考，通过上述方法检测了189个处理过的样品中CMV复制酶基因的相对表达，并在此基础上，选择了抗病植物。测试样本中，有12个样本的R0 <101、26个样本的101≤RQ<103、49个样本的103≤RO<104、81个样本的104≤RO<105和105≤RQ<106样本数为21（图3A）。3B显示了一些定量结果，RO的范围为1至80，000。了验证该测试方法的准确性，将测试结果与ELISA方法的结果进行比较以检测对CMV的抗性。果表明，单株植物的数量为3、4、7、16、42、43、50、51、55、57、65、67、69、78、86、93、99、107、115， 130、135和168在22个菌株中CMV复制酶基因的相对表达非常低，显示出抗药性，两种检测方法的结果一致（表3）。表明该研究中建立的方法可用于筛选CMV耐药性。时荧光定量RT-PCR可以根据PCR反应过程中检测到的荧光量变化来检测并记录实时PCR扩增产物的增加。用实时RT-PCR技术定量定量基因表达，桂花树价格关键步骤是制备标准曲线。

　　过创建精确的标准曲线可以获得标准曲线的斜率，并且可以计算扩增效率，从而可以排除PCR扩增效率对计算结果的影响，并且可以更精确地计算相对基因表达量。这项研究中，实时定量RT-PCR用于确定桂花植物组织中CMV复制酶基因的相对表达水平。对表达水平。用定量实时荧光RT-PCR的测试结果与使用ELISA检测CMV耐药性的结果基本一致。此，使用SYBR Green I实时定量RT-PCR技术可以确定桂花植物中桂花CMV复制酶基因表达水平的相对变化。
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