桂花树苗_黄桂花树根结线虫病的病原鉴定

核心词：桂花树苗 黄桂花树根结线虫病病原鉴定 黄桂花树根结线虫病病原鉴定的 病原鉴定 
目录：
1、黄桂花树Okra为锦葵科Malvaceae桂花树属Abelmoschu的一个种
2、由于黄桂花树生产规模化
3、根结线虫种间存在显着的致病差异
4、在福建省漳州市采集黄桂花树根结线虫发病植株根系
5、由于寄主及环境条件的差异
　　

黄桂花树Okra为锦葵科Malvaceae桂花树属Abelmoschu的一个种

　　黄桂花树Okra为锦葵科Malvaceae桂花树属Abelmoschu的一个种,又名桂花树、补肾草、咖啡葵等。

原产于非洲,自20世纪90年代初引入我国,现国内各地均有栽培。

黄桂花树作为一种特色的保健型蔬菜,种植面积不断扩大,福建漳州地区每年黄桂花树种植面积累计达到1300多hm2,在福建省建宁、泰宁和将乐等诸县种植的黄秋奏品种洋辣、痴椒也已有百年之久。

　　

由于黄桂花树生产规模化

　　由于黄桂花树生产规模化、设施化以及连作障碍严重,根结线虫病已成为黄桂花树的最重要病害之一,极大地降低了黄桂花树的产量和质量。

黄桂花树植株根部受根结线虫侵染后,侧根和须根上产生根结,呈串珠状或鸡爪状,病原鉴定表面粗糙,容易龟裂腐烂。

由于根系畸变膨大,导致根部吸收营养成分和水分的运输功能遭到破坏,从而引起植株矮化、褪绿、落叶甚至死亡。

我国已报道的根结线虫种类为57种,其中能引起蔬菜发生根结线虫病的主要为南方根结线虫Meloidogyneincognita、象耳豆根结线虫Meloidogyneenterolobii、爪哇根结线虫Meloidogynejavanica、北方根结线虫Meloidogynehapla、花生根结线虫Meloidogynearenaria。常规的根结线虫种类鉴定主要通过形态学鉴定、鉴别寄主及生化鉴定,近十几年来,分子生物学技术的发展,为根结线虫的准确鉴定提供了重要手段。
　　

根结线虫种间存在显着的致病差异

　　根结线虫种间存在显着的致病差异,对黄桂花树根结线虫种类的鉴定是防治根结线虫病的重要前提。本研究在福建省漳州市黄桂花树种植区域监测到黄桂花树根结线虫的症状,通过病原分离鉴定,确定黄桂花树根结线虫种类,为黄桂花树根结线虫病的防治提供信息基础。
　　

在福建省漳州市采集黄桂花树根结线虫发病植株根系

　　在福建省漳州市采集黄桂花树根结线虫发病植株根系,清洗干净,挑取根系中淡黄色的单卵块至1.5mL离心管中,用1%NaClO溶液消毒5min后,无菌水清洗3次,加入无菌水室温下孵化24h后接种于易感黄桂花树上进行培养,待后期鉴定。供试爪哇根结线虫虫源由海南省农业科学院植物保护研究所惠赠,并长期培养保存于易感番茄上。会阴花纹形态学鉴定根结线虫接种8周后,取被侵染的黄桂花树根组织进行雌虫分离,分离出的单头雌虫,根结线虫成熟雌虫会阴花纹制作和观察参照刘维志和赵雷等的方法。同工酶分析参照胡凯基的方法,挑取20头雌幼虫置于1.5mL的离心管中,加入15μL酶浸提液,研碎,将酶提取物加入到7%分离胶、4%浓缩胶、胶厚1.0mm的胶孔中,运用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行同工酶酯酶分析。电泳结束后参照胡凯基的方法进行EST染色,以已鉴定的爪哇根结线虫Meloidogynejavanica为对照。酯酶表型的判读按照Esbenshade等的方法。rDNA的ITS区PCR鉴定采用Vrain等设计的引物18S和28S进行rDNAITS扩增,引物由上海生工公司合成。将黄桂花树根结线虫雌虫置于200μL的PCR管中,加入10μL灭菌水,用10μL枪头将雌虫刺破,内含物溢出,再加入8μL10×PCRBuffer,并且以终度60μg·mL-1的蛋白酶K处理,之后将样品置于-70℃30min,65℃下温育1h,95℃10min,最终常温下12000r·min-1离心≥1min,上清液可作PCR模板。PCR反应总体积为25μL,包含12.5μLMix、正反引物各1μL、线虫DNA粗提液5μL,加灭菌水补充至25μL。PCR扩增反应程序:94℃预变性4min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环,72℃充分延伸10min,4℃保温。取PCR产物5μL在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,用凝胶成像系统观测拍照。剩余PCR产物通过回收、纯化、克隆和测序后于NCBI上进行比对分析。根结线虫雌虫的会阴花纹背弓较高,花纹呈椭圆形,背弓由平滑到波浪形的线纹组成,一些线纹在侧面分叉,无明显侧线,对照文献资料,初步确定黄桂花树根接线虫为南方根结线虫Meloidogyneincognita。经同工酶的特异性染色后,黄桂花树根结线虫酯酶谱型为I2型,黄桂花树根结线虫病病原鉴定的黄桂花树根结线虫病病原鉴定为南方根结线虫Meloidogyneincognita酯酶谱型。以黄桂花树根结线虫粗提液为模板,用引物18S和28S扩增rDNA的ITS区序列。结果得到ITS片段均为750bp左右。对rDNAITS区序列进行克隆与测序,产物大小为765bp,将测序结果提交NCBI进行分析,与已知MeloidogyneincognitaITS区编码序列相似性达到99,由此确定黄桂花树根结线虫病的病原为南方根结线虫Meloidogyneincognita。黄桂花树是兼食用和观赏的作物,由于根结线虫病是一种隐蔽性强的植物病害,不易被及时发现,所以根结线虫侵染后往往导致黄桂花树产量大大降低,植株叶片发黄而失去观赏价值。因此,应当进一步广泛、深入地开展黄桂花树根结线虫病的研究,为黄桂花树育种和根结线虫病防治提供技术支持。目前国内天津地区为害黄桂花树的根结线虫种类是南方根结线虫Meloidogyneincognita,国外也有报道为害黄桂花树的根结线虫种类是南方根结线虫Meloidogyneincognita和象耳豆根结线虫Meloidogyneenterolobii。
　　

由于寄主及环境条件的差异

　　由于寄主及环境条件的差异,根结线虫形态上会存在着一定的变异。形态特征较多依赖雌虫会阴花纹的观察,黄桂花树根结线虫病病原鉴定桂花树苗表型判定标准对常见根结线虫种群鉴定准确而有效,rDNAITSPCR技术是通过对区序列进行测序,并将测序获得的序列与已知线虫序列进行对比,从而获得未知线虫属信息的方法,该方法在根结线虫上已得到广泛应用。因此本研究利用会阴花纹形态学、同工酶分析和分子生物学手段相结合的方法对黄桂花树病原线虫进行种类鉴定,发现黄桂花树根结线虫病的病原为南方根结线虫Meloidogyneincognita。