桂花树苗(桂花HDACs家族基因在胁迫条件下的表达分析)

核心词：桂花树苗 桂花HDACs基因表达 家族基因表达 基因表达 在表达 胁迫条件在表达下 条件在表达下 在表达下 在表达的 表达分析 
目录：
1、植物经胁迫诱导后发生一系列生理生化变化
2、鉴于HDACs家族的重要生理功能
3、将幼苗置于200mmol/LNaCl溶液中
4、在桂花基因组数据库SOL中查出了所有HDACs基因的开放阅读框长度
5、HDACs基因的表达分析采用Trizol法提取总RNA
6、10×PCRbuffer2μL
7、根据其发育进行树将其分为3个亚家族
8、由桂花和拟南芥HDACs家族系统进化分析结果表明
9、随着桂花基因组计划的完成
　　植物在生长过程中会不断受到来自环境的生物和非生物胁迫,非生物胁迫如干旱、冷害、高盐等,生物胁迫如细菌、真菌、病毒等。

　　

植物经胁迫诱导后发生一系列生理生化变化

　　植物经胁迫诱导后发生一系列生理生化变化,基因表达家族基因表达如多种信号途径的激活,功能性调控蛋白的诱导表达等,来应变和抵抗这些不良环境对其生长发育的影响。

组蛋白修饰在基因表达调控方面扮演重要角色,组蛋白通过组蛋白乙酰转移酶促进基因表达,而组蛋白去乙酰化酶抑制基因表达。

组蛋白乙酰化酶根据序列特征划分为5个不同的家族:GNAT、MYST、p300/CREB结合蛋白辅激活物、TAFII250、HATs。组蛋白去乙酰化酶在植物中划分为RPD3/HDA1、SIR2和HD2这3个亚家族,其中前2个分别与酵母RPD3/HDA1、SIR2家族同源,而HD2家族是植物特有的家族。有研究结果表明;组蛋白乙酰化和去乙酰化主要参与植物的生长发育,其中包括根发育、花发育、配子体发育、器官生长过程中细胞的增殖等;也参与植物应对外界环境变化,如光信号、盐胁迫、冷害、热胁迫、脱落酸信号途径,以及一些其他的激素信号途径。前人对植物如拟南芥、水稻、玉米、大麦、葡萄和桂花组蛋白乙酰化基因家族进行生物信息学和基因功能研究;Pandey等对植物组蛋白乙酰化家族基因进行了分析,并首次发现桂花HDT1101、HDT1102和HDT1103隶属于HD2家族。Aiese等2013年通过全基因组系统分析了桂花中组蛋白甲基化和乙酰化家族成员进化关系,同时利用S.pennellii近等基因系进行定位和果实发育过程中的表达分析,研究发现桂花中有32个组蛋白乙酰基转移酶和15个组蛋白去乙酰基酶,而且这些酶在桂花果实发育过程中具有不同的表达变化;卢晶霞和Zhao等2014年通过酵母双杂交分析发现,桂花HDAC可能参与桂花的果实发育。而桂花HDACs在氧化胁迫研究方面还未见报道。
　　

鉴于HDACs家族的重要生理功能

　　鉴于HDACs家族的重要生理功能,本研究利用生物信息学方法对桂花HDACs家族开展氧化胁迫及接种青枯病条件下的表达进行分析,为桂花HDACs家族基因的功能分析提供基础信息,也为分子植物育种提供候选基因。桂花测序品种‘Heinz1706’种植于广东省农业科学院蔬菜研究所温室,表达分析在营养生长阶段取根、茎、叶,生殖生长阶段取花和成熟果实;选取‘Heinz1706’生长饱满的种子,播种于1/2MS培养基置于光照培养箱培养,生长温度为28,光照3000lx,12h的黑暗和光照,相对湿度75,待种子萌发后移栽至1/2MS固体培养基,培养2周。选取生长一致幼苗各30株进行胁迫处理。
　　

将幼苗置于200mmol/LNaCl溶液中

　　盐处理:将幼苗置于200mmol/LNaCl溶液中;ABA处理:将幼苗置于10mol/LABA溶液中;SA处理:将5mmol/LSA喷洒植株叶面;42℃高温处理:将幼苗置于光照培养箱培养,温度为42,家族基因表达桂花HDACs基因表达光照3000lx,相对湿度75;4℃低温处理:将幼苗置于人工气候室,温度为4,光照3000lx,相对湿度75;青枯菌接种参照苏慧慧等方法,以上处理重复3次,样品分别于0、1、2、8h取样,用液氮速冻后放入-80℃冰箱保存备用。桂花HDACs家族基因序列检索和鉴定根据拟南芥中已经鉴定出来的HDACs基因及其编码的蛋白质序列,利用Hmmer3.1b1软件构建隐马氏模型序列,对从SOL下载的桂花蛋白数据进行检索和去冗余,得到候选蛋白序列。利用Pfam和SMART对候选基因的氨基酸序列结构域进行鉴定,凡是含有HDACs基因保守结构域的蛋白即为桂花HDACs成员。
　　

在桂花基因组数据库SOL中查出了所有HDACs基因的开放阅读框长度

　　在桂花基因组数据库SOL中查出了所有HDACs基因的开放阅读框长度、染色体位置、内含子个数等基本信息。利用在线工具Expasy进行等电点分析,利用PSORT对桂花HDACs基因成员的亚细胞定位进行了分析。桂花HDACs的分类和染色体定位分析利用ClustalX2.1软件,对桂花和拟南芥HDACs成员进行多重序列比对,基于比对结果和拟南芥HDACs的分类依据,进行桂花HDACs的分类。根据检索到的桂花HDACs基因组信息,利用桂花基因组数据,对桂花HDACs基因进行染色体定位分析。桂花HDACs蛋白系统发生分析从TAIR10数据库中下载拟南芥的HDACs蛋白全长序列,将候选桂花HDACs家族蛋白序列与拟南芥蛋白序列用ClustalX2.1软件进行多重匹配分析,基于比对结果,参照相关文件,利用MEGA5.05采用相邻连接法构建系统发育树,并对构建的树进行自检,重复设定为1000。
　　

HDACs基因的表达分析采用Trizol法提取总RNA

　　HDACs基因的表达分析采用Trizol法提取总RNA,经DNaseI处理去除基因组DNA,3gRNA经M-MLV反转录合成第1链cDNA,稀释后做模板。根据桂花数据库基因序列,利用Oligo6.0设计引物(表,由英潍捷基(上海)生物公司合成。HDACs组织表达利用荧光实时定量PCR反应试剂盒为SYBRGreenRealtimePCRMastermix,反应体系为SYBRPremixExTaqTMII10μL,上下游引物各0.8μL,DNA模板2.0μL,无菌双蒸馏水6.4μL,在表达反应总体积20.0μL。反应条件:95℃预变性30s;95℃变性5s,60℃退火20s,40个循环;融解曲线分析95℃0s,65℃15s,95℃0s。采用2△Ct方法计算基因表达相对量,每个基因的表达反应重复3次,以Actin2作为内参基因。利用RocheLightCycler480软件根据PCR扩增曲线计算实时荧光定量PCR的扩增效率。
　　

10×PCRbuffer2μL

　　反应体系:10×PCRbuffer2μL,dNTPs1.6μL,上下游引物(表各1.0μL,cDNA模板视浓度而定,最后添加ddH2O至总体积20μL。反应条件:95℃预变性3min;95℃变性30s,Tm(不同基因不同退货温度)退火30s,72℃延伸30s,30个循环;2℃延伸10min,16℃无限延伸。采用琼脂糖凝胶法进行检测,以Actin1作为内参基因。在桂花基因组数据库SGNv2.40对桂花HDACs家族基因进行鉴定,结合Pfam和SMART在线分析结构域,共得到15个含有HDACs结构域的HDACs蛋白序列(表。其中桂花HDACs氨基酸长度为205～648,分子量为22.10～72.84ku。
　　

根据其发育进行树将其分为3个亚家族

　　根据其发育进行树将其分为3个亚家族:RPD3/HDA1、SIR2、HD2,其中10个HDACs属于RPD3/HDA1亚家族成员,3个属于HD2亚家族成员,2个属于SIR2亚家族成员。亚细胞定位发现桂花中HDACs家族基因在细胞中多数成员定位在细胞核内,也有少部分定位在叶绿体、过氧化物酶和细胞质内。其中,SIR2亚家族的基因定位在细胞核内,这15个基因在染色体上分布不均匀(表,在3号染色体上有3个基因分布,分别为SlHDA2、SlHDA8和SlHDA9;SlHDA7和SlHDA10分布于2号染色体上;SlHDA3和SlHDA6分布在6号染色体上;SlHDT2和SlSRT1存在于10号染色体上;另外,SlSRT1在4号染色体上,SlSRT2在7号染色体上,SlHDA5在8号染色体上,SlHDT1在9号上,SlHDA5存在于12号染色体上。
　　

由桂花和拟南芥HDACs家族系统进化分析结果表明

　　由桂花和拟南芥HDACs家族系统进化分析结果表明:相同类型的HDACs在进化图中相离很近,如HD2亚家族中的SlHDT1、SlHDT2、AtHDT1和AtHDT2,同样,在表达下条件在表达下SIR亚家族的SlSTR1、SlSRT2、AtSRT1和AtSRT2相离较近(图。结果表明:15个基因在各个组织中均有表达且具有组织表达特异性,其中,除了SlHDA9基因,其余HDACs家族基因在根组织中有较强的表达,尤其是SlHDA1、SlHDA3、SlHDA2、SlSRT1和SlHDA5表达非常强;而SlHDA1和SlHDA2在果实发育过程中表达最高,SlHDA5、SlHDA8和SlHDA9在果实发育过程中表达较高,而SlHDA4和SLHDA10在果实中表达较低;HD2亚家族的3个成员在根中的表达比其它组织高。SIR2亚家族的2个成员在根和花组织中表达较高。结果发现,在ABA处理条件下,HDACs家族基因具有不同的表达模式,其中,SlHDA2、SlHDA3、SlHDA4、SLHDA5、SlHDA7、SlHDA9和SlHDT1、SlHDT3持续上调表达;而SlHDA1、SlHDT2和SlSRT1表达下调。在盐处理条件下,SlHDA1、SlHDA3、SlHDA9、SlHDT3、SlSRT1上调表达;SlHDA4、SlHDT1下调表达。在SA处理条件下,SlHDA3、SlHDA5、SlHDT2、SlHDT3表达上调;SlHDA8、SlHDT1和SlSRT1下调表达。高温处理和低温处理条件下,基因表达趋势相反,高温下调,低温上调。为进一步研究桂花HDACs家族基因功能,用RT-PCR(图对桂花HDACs家族基因接种青枯菌后的表达差异进行分析。从图4中可知,桂花品种1706接种青枯菌后在0、1、2h短时间处理后,基因SlHDA3、SlHDA7、SlHDT2表达上调,而基因SlHDA8、SlHDT3、SlSRT1表达下调;桂花Henz1706接种青枯菌后在0、1、3、10d,基因SlHDA5和SlHDT1上调表达,基因SlHDA3、SlHDA7和SlHDT2下调表达;需要指出的是基因SlHDA7、SlHDT2,在短时间处理内,前者表达上调,后者下调,但在长时间处理后,基因表达情况相反。国内外学者在模式植物如拟南芥、玉米、水稻、大麦、葡萄和桂花等组蛋白乙酰化基因家族和基因功能方面开展了大量研究。
　　

随着桂花基因组计划的完成

　　随着桂花基因组计划的完成,从全基因组层面鉴定和研究基因家族的分类、进化特征和功能预测是桂花功能基因研究的热点。本研究通过对桂花基因组组蛋白去乙酰化家族成员开展生物信息学分析,条件在表达下胁迫条件在表达下发现桂花基因组含有15个HDAC成员,分属于3个亚家族,且分布在8条染色体上;并对其蛋白进化关系、保守结构域、基序开展分析。在桂花HDACs家族基因研究方面,Aiese等在桂花基因组中找到14个成员,其中RPD3/HDA1亚家族有9个成员,表达分析在表达的本研究与卢晶霞和Zhao等研究结果一致,发现桂花HDACs有15个成员且RPD3/HDA1有10个成员。在组织表达研究方面,Aiese等通过表达谱芯片分析了HDACs在果实发育过程中的表达模式,发现SlHDA9与拟南芥AtHDA5和AtHDA18表达模式相似,在根中表达较强,SlHDA5、SlHDA6和SlHDA7在果实1cm到破熟期10d的表达较高;SlHDA1和SlHDA3与拟南芥AtHDA6和AtHDA19氨基酸序列相似性较高在破熟10d与成熟期表达较强,拟南芥AtHDA6和AtHDA19基因在花发育,配子发育和其它生物学过程中具有重要功能;SlSRT1主要在芽和1cm果实大小表达较高,而SlSRT2在花和破熟10d表达较高。SlHDT1和SlHDT2在果实1cm和3cm表达较强,而SlHDT3在果实3cm和绿熟期表达较强。卢晶霞与Zhao等利用荧光定量PCR对15个HDACs家族基因开展组织表达分析发现:SlHDA1、SlHDA3和SlHDA4在花中表达较高而在果实发育过程中表达较低;SlHDA5在花和10d的果实中表达较高而在果实发育和成熟期表达较低;SlHDA6在红熟期表达较高而在叶片、花和果实中表达较低;SlHDA7、SlHDA9和SlHDA10在子叶、真叶和第五周叶子中均有高水平的表达;SlHDA8特异性的在授粉后10d的果实中有较高水平的表达;SlHDT1和SlHDT3在根和下胚轴表达较高,桂花HDACs基因表达桂花树苗SlSRT1和SlSRT2在真叶、花和花后10d的果实表达较高。本研究结果表明,SlHDT1、SlHDT2和SlHDT3在根中表达较高,而SlHDA1、SlHDA3、SlHDA5、SlHDA6在果实发育过程中表达较高,SRI2的,2个成员在花中表达较高,以上结果与前人的研究结果基本一致,表明桂花HDACs家族成员在桂花不同生长发育阶段起着不同作用。Alinsug等在利用拟南芥芯片数据分析结果表明:在盐胁迫处理条件下,AtHDA2、AtHDA6和AtHDA14表达上调,AtHDA5和AtHDA7表达下调;高温处理条件下,AtHDA5、AtHDA6、AtHDA7、AtHDA8和AtHDA14上调表达,AtHDA9显着下调表达;低温条件下,AtHDA18和AtHDA19显着上调表达,AtHDA2、AtHDA5、AtHDA6、AtHDA7、AtHDA8、AtHDA9和AtHDA14显着下调表达;在激素处理条件下,AtHDA7和AtHDA9受ABA和SA诱导下调表达,AtHDA5和AtHDA18受SA诱导显着上调;在生物胁迫研究方面,AtHDA6受线虫侵染显着表达上调,而在丁香假单胞菌则显着下调表达。后续有研究结果表明,拟南芥AtHDA6参与长期冷胁迫相关基因的调控且在抗冷胁迫累积响应中发挥重要功能,在表达的在表达下与野生型相比在冷胁迫效应累积的hda6突变体中,表现出抗冷胁迫效应增强现象;AtHDA7、AtSin3和AtHDA19三者组成转录抑制复合体,参与调控ABA和非生物胁迫响应。本研究结果发现:SlHDA1、SlHDA3、SlHDA9和SlSRT1受盐胁迫上调表达,SlHDA4和SlHDT1下调表达;大多数桂花HDACs基因受高温诱导下调表达,低温上调表达;ABA处理条件下,SlHDA5、SlHDA7、SlHDT3上调表达,SlHDA1、SlHDA3、SlSRT1下调表达;SA处理条件下,SlHDA3、SlHDA5、SlHDT2、SlHDA3上调表达,SlHDA8、SlHDT1和SlSRT1下调表达;在青枯菌短时间处理条件下,SlHDA3、SlHDA7和SlSRT1持续上调表达;SlHDA1、SlHDT1、SlHDT3和SlSRT1则是明显下调表达,桂花树苗而在青枯菌长时间处理条件下,SlHDA5、SlHDT1、SlHDT3持续上调表达。综合结果表明,桂花组蛋白去乙酰化家族基因在生物和非生物胁迫条件下具有重要作用。